| 研究実績の概要 |
モデル動物より臓器を摘出し、以下の手順でメタボローム解析を行なった。
1, 臓器を凍結乾燥し、ジルコニアビーズを加え、チューブごと液体窒素で凍結した. 2,ボールミルを用いて20 Hz, 5 minで臓器を粉砕した. 3,2.0 mLエッペンドルフチューブに乾燥重量15 mg (0.00まで計測)以上の臓器粉末を入れた. 4, Mix Solvent (MeOH: H2O: CHCl3 =5: 2: 2)を臓器濃度が15 mg/mLとなるように添加した. 5, 20 secボルテックス後、16,000 rpm, 3 minで遠心した. 6, 新しい1.5 mLエッペンドルフチューブに上清900 μLを加え、その後、MilliQ (未滅菌)を400 μL添加した. 7, 16,000 rpm, 3 minで遠心し、新しい 1.5 mLエッペンドルフチューブに水層を800 μL, クロロホルム層を100 μL取得した. 8, 遠心エバポレータで有機溶媒を留去した. 9, 有機溶媒留去後、-80℃で凍結し、凍結乾燥を行った. 10, 凍結乾燥サンプルに40 mg/mL Methoxyamine hydrochloride pyridine溶液 10 μL, 0.75 mg/mL d27-Myristic acid n-hexane溶液10 μLを添加した. 11, 加温振盪機で30℃, 1,200 rpm, 90 minで振盪した. 12, N-Methyl-N-trimethylsilul-trifluoroacetamide (MSTFA)+ 1% TMCSを90 μL添加し、37℃, 1,200 rpm, 30 minで振盪した. 13, 16,000 rpmで遠心し、上清を分析サンプルとした.
その結果、水層、クロロホルム層の双方において、複数種類の代謝物で有意差を認めた。
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