| 研究課題/領域番号 |
19H03765
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
伊東 雅基 北海道大学, 大学病院, 助教 (10399850)
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| 研究分担者 |
中山 若樹 北海道大学, 医学研究院, 講師 (40421961)
佐藤 典宏 北海道大学, 大学病院, 教授 (50360912)
矢部 一郎 北海道大学, 医学研究院, 教授 (60372273)
数又 研 北海道大学, 大学病院, 講師 (60634144)
浜内 祝嗣 北海道大学, 医学研究院, 助教 (70794387)
寳金 清博 北海道大学, 保健科学研究院, 特任教授 (90229146)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | もやもや病 / 発症素因 / 病態修飾因子 / 血漿microRNA / エピゲノム / RNF213 / 創始者変異 |
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| 研究実績の概要 |
研究の初年度にあたる2019年度は、もやもや病特異的血漿microRNAの発現解析を行うための対象者集団の選定から開始した。前期は、これまでに蓄積したもやもや病患者レジストリ/生体試料ゲノムバンクの登録症例のうち、もやもや病確定診断例連続168症例、比較対照者用血液ゲノムバンクの全142名のDNAを用いてRNF213創始者変異(p.R4810K)のバリアントタイプを、real-time PCR Taqman assayにて評価した。その上で対象者の採血時点の年齢、性別、RNF213創始者変異SNP型をもとに疾患群と比較対象群でマッチさせて、合計160名（患者群82名、比較対照健常者群78名）の対象集団とした。RNF213創始者変異（p.R4810K）の変異型は、もやもや病患者群（バリアント76.8％・野生型23.2％）、健常者群（バリアント2.6％・野生型97.4％）と、想定される既報通りの差異となった。後期は、血漿microRNAを定量装置として、real-time PCRカスタムアレイ（miRCURRY LNA microRNA PCR array）の設計を開始した。設計の準備段階として、本製品自体の評価定量系の性能を確認するため、代表的なもやもや病患者血漿サンプル２検体を用いて、血漿から全RNAを抽出・精製・品質評価の一連の工程を行い、384種のmicroRNA発現定量解析を実施した。その結果、今回定量を計画している17種の関心microRNAのうち、4種は問題なく測定可能、1種は測定感度以下、12種はPCR probe設計をしなければ定量ができないことが判明した。また、複数サンプルの定量PCRに必要な内部標準microRNA6種類と、spike-in control1種類の定量は十分可能であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
令和元年10月までに、 対象者の決定、RNF２１３創始者変異バリアントタイプの決定、一部被験者の血漿全RNAの抽出と、miRCURRY LNA microRNA PCR array性能の評価を予定通りに実施した。その結果、当初の想定に反し、目的とするmicroRNA測定に使用する17種の実験装置のうち、12種について新たに設計を要することが判明した。研究遂行上、本実験を行うにはこれらの実験装置の設計が不可欠なた め、実験装置の再設計を追加で行い、予備実験(microRNA測定)をやり直す必要が生じ、測定機器の微調整を行った。本遅延については、研究に際しての事前調査は困難であり、止むを得ず研究の遅れを生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度後期で、全てのPCR probe設計と測定機器の微調整を終えることができた。もともと多数検体を用いて複数ターゲットのmicroRNA定量を行えるハイスループット実験機器を用いる計画であり、全検体を用いた測定jは次年度前期早期に開始可能である。このため、当初の目的は計画期間内に達成可能と考える。
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