| 研究課題/領域番号 |
19H03803
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
山本 典生 京都大学, 医学研究科, 准教授 (70378644)
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| 研究分担者 |
西村 幸司 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (20405765)
中川 隆之 京都大学, 医学研究科, 研究員 (50335270)
大西 弘恵 京都大学, 医学研究科, 研究員 (50397634)
岡野 高之 京都大学, 医学研究科, 助教 (60642931)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 単一細胞 / 網羅的遺伝子解析 / 蝸牛上皮 |
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| 研究実績の概要 |
野生型マウスE13.5蝸牛の内耳骨包原基を除去して、膜迷路を剖出した後、血管条を機械的に除去した。さらに、サーモライシンを用いて結合組織を取り除いて上皮のみにしたのち薬剤を用いて細胞を単離した。単離した細胞を１つずつピックアップし、その単一細胞に対してRNAの抽出からcDNAの合成・増幅を、アダプターを用いた増幅法を用いて行った。アダプターを用いたことにより、増幅はもともとのmRNAの発現量に直線的に比例した形で行われている。2019年度は、cDNAの合成まで行ったサンプル数は112サンプルである。
これら112サンプルで、cDNA合成が正常に行われているか、つまりcDNAの品質を検定するために、合成したcDNAを用いて２種類のハウスキーピング遺伝子、GapdhとArbpのプライマーを用いてPCRを行った。112サンプルのうち、ハウスキーピング遺伝子の検出ができたのは、75サンプルであった。つまり、7割弱でcDNAの合成に成功した。さらに、これらのcDNAの合成に成功したサンプルを用いて、感覚上皮予定領域のマーカーであるSox2のプライマーを用いたPCRも行った。75サンプル中、47サンプルがSox2陰性、28サンプルがSox2陽性であった。
回収したサンプル数は目標とする100を上回り、かつ、50以上のSox2陰性細胞のサンプル数回収の目標もほぼ達成したが、本研究での解析対象のSox2陽性細胞のサンプル数が28サンプルと少ないため、さらなるサンプルの収集が必要である。
一部のSox2陽性やSox2陰性の細胞から調整したcDNAに関して、マイクロアレイチップとのハイブリダイズも2019年度中に進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
回収するサンプル数に関しては目標100サンプルに対して、112サンプルの回収を行い、目標通りであった。また、今後の網羅的遺伝子発現解析に適するかどうかの品質チェックも順調に進んでおり、チェックが終わったサンプルはマイクロアレイチップとのハイブリダイズの作業に投じている。こちらも予定通りである。また、本研究の解析では、感覚上皮予定領域以外の領域由来と判定されるSox2陰性細胞からのサンプルを50以上収集することを目標としていたが、その目標もほぼ達成できた。
ただ、本研究での解析の主なターゲットである感覚上皮予定領域のSox2陽性細胞のサンプルは28サンプルとまだ数が少ないと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
2020年度は、追加でサンプルの採取を行い、Sox2陽性細胞由来のサンプル数を増加させることが必要である。合計150サンプルほどの回収が達成できれば、Sox2陽性細胞のサンプルが45ほどになると見込まれる。その上で、マイクロアレイチップへのハイブリダイズをさらに進めていき、網羅的遺伝子発現解析を行って、感覚上皮予定領域の一部の領域を代表するマーカー遺伝子の候補を同定する。
さらに、同定した候補の遺伝子について、内耳発生過程での発現の有無をまずRT-PCRで測定する。発現が確認された場合、定量的RT-PCRを行う。必要なプライマーを準備して、該当遺伝子のmRNAの定量が可能であることを予備実験で確認後に、さまざまな発生段階（E9からP10程度まで）の蝸牛から調整したサンプルを用いて、各時期の該当遺伝子のmRNA発現量の測定を行う。これにより、発生段階のどの時期で重要な役割を果たしているかを検証できる。また、in situ hybridization法を用いて、候補遺伝子の蝸牛内発現部位評価も進める。反応に用いるプローブを調整するためのプラスミドを、候補遺伝子の配列を検討してコンストラクトする。その後、ポジティブコントロールとなる組織を用いて、in situ hybridization法を行い、確実に候補遺伝子のmRNAが検出できることを確認後に、さまざまな発生段階（E9からP10程度まで）の内耳組織を用いて反応を行う。発現部位は、特に、Sox2陽性領域との位置関係に注目をする。有望な遺伝子が見つかった場合は、該当の遺伝子のノックアウトマウスの作成の準備を始める。CRISPER-CASのシステムを使用する予定であるので、遺伝子配列を検証してターゲットの部分の選定を行った後に、必要なコンストラクトの準備を行う。
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