| 研究課題/領域番号 |
19H03830
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
岩山 智明 大阪大学, 歯学研究科, 助教 (80757865)
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| 研究分担者 |
竹立 匡秀 大阪大学, 歯学部附属病院, 講師 (60452447)
村上 伸也 大阪大学, 歯学研究科, 教授 (70239490)
山下 元三 大阪大学, 歯学部附属病院, 講師 (90524984)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 歯根膜 / シングルセル解析 / ヒエラルキー / RNA Velocity |
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| 研究実績の概要 |
歯周組織の構成細胞のヒエラルキーを決定し、その制御因子を解明するために、A)ATAC-seq法によるマーカー遺伝子探索による歯根膜MSCの定義、B)歯根膜特異的Creマウスを用いた系譜解析による「歯根膜細胞」の定義、C)Trajectory解析による歯根膜中の細胞ヒエラルキーの決定、D)分化度を決定する転写因子の探索とCRISPR/Cas9による機能解析、の4つの研究方法を計画しており、本年度は以下のような成果を得た。
昨年度作製した歯根膜特異的蛍光レポーターマウス（PLAP1-GFP）を活用することにより、まず、酵素を用いた歯根膜からの細胞分取法開発に成功し、十分な生細胞数・生細胞率を得たため、シングルセル解析を実施した。遺伝子発現から再構成するTrajectory解析のみならず、mRNAの成熟度を用いて時間軸を推定する最新手法であるVelocity解析を併用し、歯根膜の分化経路を推定できた。同解析結果より、AおよびCの目的である歯根膜MSCのマーカー遺伝子や歯根膜中の細胞ヒエラルキーの決定が概ね達成された。
また、Bについて、昨年度作製した歯根膜特異的Creマウス（PLAP1-CreERT2）をレポーターマウスと掛け合わせることで、歯根膜細胞の系譜解析を行い、歯根膜の細胞が骨芽細胞やセメント芽細胞へと分化することをin vivoで実証した。
さらに、Dについて、昨年度に歯根膜細胞の石灰化を亢進する分子として見出したZbp1について、ノックアウトマウスを入手し、絹糸結紮歯周炎モデルを用いて、その再生過程における機能を解析し、in vitroの解析結果と合わせて論文発表を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
課題であった歯根膜単離法について、新しく作製したレポーターマウスを用いることで開発に成功した。これによりシングルセル解析が実施でき、さらに最先端の解析技術であるRNA Velocityを用いてヒエラルキーの推定が実施できたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
シングルセル解析により得られた結果を組織学的に検証し、歯根膜のヒエラルキーの全体像を解明する。予定通りATAC-seq法も実施することにより、シングルセル解析により同定された分子マーカーを検証する。
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