| 研究課題/領域番号 |
19H03846
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
柳川 徹 筑波大学, 医学医療系, 教授 (10312852)
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| 研究分担者 |
田渕 克彦 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (20546767)
蕨 栄治 筑波大学, 医学医療系, 講師 (70396612)
内田 文彦 筑波大学, 附属病院, 病院講師 (70736008)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | p62 / 口腔癌 |
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| 研究実績の概要 |
I. 基礎的探求として、1．in vitroの解析： p62にある核排出シグナルのNES（NES: Nuclear export signal）配列にミューテーションをゲノム編集により導入し、ΔNESp62と通常のp62発現ベクターを制作し、p62-/-MEF細胞に導入した。その後、エクスポーチン阻害剤であるレプトマイシンB（LMB）処理で核排出を止めた際のp62の細胞内局在を蛍光レーザー顕微鏡で観察したところ、p62の核蓄積はLMB処理後１時間から見られ24時間後にはさらに核に蓄積していた。LMB毒性の時間・濃度依存性をMTT試薬により生細胞活性を調べたところ、WTではLMBにより著名な生存細胞の減少が認められたが、p62-/- MEFでは減少しなかった。LMBによるApoptosisについてCleaved Caspase-3の発現量で評価したところp62-/- MEFでは低下が認められた。
２．in vivoの解析： FLExシステムとCre ERT2をドライバーとしたコンディショナルノックイン、また、NESとNLS（NLS: nuclear localization signal）配列のみに変異をいれたベクター製作をおこない、ノックインマウス制作を開始した。
II. 臨床的探索として、前癌病変の口腔白板症患者50例のパラフィン包埋組織および臨床指標（年齢 , 性別 , 部位 , 発生様式 , 飲酒歴 , 喫煙歴）、上皮異型有無を収集した。p62抗体、8-OHdG抗体、Ki67抗体、p53抗体を用いて免疫組織化学染色を行い、結果をχ二乗検定と多変量ロジスティック解析により検討した。結果、 p62核染色とp62凝集と上皮異形の関連性に有意差を認めた(P<0.05)。以上から、臨床標本ではp62の細胞内蓄積が，悪性化のリスク因子となる上皮異型の関連あることが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在までは、I. 基礎的探求として 1．in vitroの解析についてはベクターやMEF細胞への導入、また、蛍光顕微鏡による局在の同定、視覚化など、実験の手技・方法としては順調に進んでいる。また、実際の解析の結果としても、p62の核と細胞質とのシャトリングと細胞のApoptosisとの関連が予想通りの帰結として明らかになり、仮説検証は順調に進んでいる。２．in vivoの解析については、 FLExシステムとCre ERT2をドライバーとしたベクターについては、コンディショナルノックインの制作が困難そうなこともあり、代替策を検討した。その方法として、NESとNLSに変異をいれたベクター製作へ変更することによって、その問題を解決しつつある。また、受精卵にインジェクションを行ってF0ファウンダーマウスを制作の準備も進行中であるため、ノックインマウス制作の進捗状況も良好である。
II. 臨床的探索として、前癌病変の口腔白板症患者50例のパラフィン包埋組織および臨床指標、病理の指標の収集やp62抗体、8-OHdG抗体、Ki67抗体、p53抗体を用いて免疫組織化学染色も順調に進み、p62核染色とp62凝集と上皮異形の関連性に有意差を認めたことから、臨床標本ではp62の細胞内蓄積が悪性化のリスク因子となる上皮異型に関連があることが示され、予想より早く進行している。以上から、おおむね順調であると考えられている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究推進方策としてはI. 基礎的探求として1．in vitroの解析についてはベクターやMEF細胞への導入は順調に進んだため、細胞p62の核と細胞質へのシャトリングと細胞のApoptosisとの関連について、TUNNEL染色によるApoptosisの起きている部位の局在や、ユビキチン化の観点からのアプローチなどを考慮して進めていく。２．in vivoの解析については、 FLExシステムのコンディショナルノックインの制作が困難そうなこともあることから、NESとNLSに変異をいれたベクター製作へ変更することによってノックインマウス制作に方向性を絞って行う予定である。一方、新型コロナウイルス感染症の感染拡大にともなう動物資源センターの業務の縮小から、遺伝子マウスの制作が滞る可能性が出てきた。マウスの凍結受精卵による保存などで、マウス維持が困難になった場合の準備をしておく必要が出ている。遺伝子改変マウスの解析が大幅に遅滞する可能性がであるため、解析をおこなう順序を変更する必要があることも考慮する。
II. 臨床的探索については、前癌病変の口腔白板症患者の病理検体および免疫組織化学染色も順調に進み、p62核染色とp62凝集と上皮異形の関連性に有意差を認めたことから、コンピューター上で出来る作業に切り替えて統計処理などに重点をおく。これらによって、新型コロナウイルス感染拡大の影響を最小限にとどめる方策を見出しながら研究を進めていく予定である。
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