| 研究課題/領域番号 |
19H03885
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| 研究機関 | 三重大学 |
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研究代表者 |
及川 伸二 三重大学, 医学系研究科, 准教授 (10277006)
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| 研究分担者 |
村田 真理子 三重大学, 医学系研究科, 教授 (10171141)
冨本 秀和 三重大学, 医学系研究科, 教授 (80324648)
小林 果 三重大学, 医学系研究科, 講師 (70542091)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 認知症 / 血液 / エクソソーム / プロテオミクス解析 / バイオマーカー |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、認知症患者の早期診断バイオマーカーを探索し、健康寿命の延長に寄与することである。現在、わが国の認知症患者は500万人まで増加し、2025年には高齢者の5人に1人が認知症になると推計されている。認知症の治療や介護にかかる社会的負担も増加し、2014年には約5兆円だったとの報告もなされている。認知症患者の介護のための介護離職も増加しており、大きな社会問題となっている。また、認知症患者の多くは、記憶や認知機能および思考能力を不可逆的に障害される進行性の難治性疾患であるため、患者のみならず家族の生活の質（QOL）を著しく悪化させる。以上のように、認知症患者が急速に増加し社会的問題となっていることから、認知症を早期に発見するバイオマーカーの開発が急がれている。しかし、早期の認知症患者の多くは病院を受診しないことから、多数の患者が疾患に気づかぬまま見逃されている。本研究では、認知症の大部分を占めるアルツハイマー型認知症と血管性認知症を早期に診断できる血液バイオマーカーを、両疾患の共通の原因の一つである酸化ストレスによって傷害されたタンパク質を指標に明らかにする。また、最近、病態を反映するバイオマーカーの探索で注目を集めている血中エクソソームに着目し、エクソソーム内包のタンパク質の解析を行う。本年度は、早期のアルツハイマー型認知症患者の血液の採取とエクソソームの分離、血漿酸化損傷タンパク質の解析などを行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
神経心理テストなどにより選別した早期のアルツハイマー病の患者から血液を採取し、血漿を分離した。さらに、血漿中からゲル濾過クロマトグラフィー法を用いてエクソソームの単離を行った。血漿中の酸化損傷タンパク質においては、まず血漿中から高濃度タンパク質（アルブミンなど）を除去し、次いで精製キットを用いて、タンパク質の精製・濃縮を行った。そのタンパク質を等電点で分離（一元電気泳動）後、酸化損傷の指標であるカルボニル基と反応する2,4-ジニトロフェニルヒドラジン（DNPH）で処理を行い、二次元電気泳動により個々のタンパク質に分離しPVDF膜に転写、特異的な抗体を用いたウェスタンブロット法で酸化損傷タンパク質を検出した。健常者と比較して、統計解析により1.5倍以上タンパク質の酸化損傷が増加したスポットを6つ選択した。血漿中からのエクソソームの単離は、ゲル濾過クロマトグラフィー法を用いて行ったが、回収量が一定せず、その原因が個体差なのかゲル濾過法に用いる担体の質なのかはっきりしないことから、現在スピンカラム法を用いてエクソソームの単離を行いウェスタンブロット法および免疫電子顕微鏡法を用いてエクソソームの確認を行っている。あわせて、アルツハイマー病患者の早期に有効と考えられ、アミロイドβの核形成や凝集過程の抑制が報告されている抗酸化剤モリンの安全性の検討も行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、早期アルツハイマー病患者から回収した血漿とエクソソームから抽出したタンパク質の解析を続ける。血漿タンパク質の解析方法は、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動解析システム（2D-DIGE）法を用い、レーザースキャナーにより蛍光強度を測定し網羅的にタンパク質発現量の統計解析を行う。健常者と比較し有意差のあるスポットについては、飛行時間型質量分析装置(TOF/TOF-MS)とデータベースを用いて個々のタンパク質を同定する。酸化損傷タンパク質については、特異的な抗体を用いて二次元電気泳動法/ウエスタンブロット法の併用にて検出する（2D-Oxyblot）。2D-DIGE法と2D-Oxyblot法により酸化損傷タンパク質の損傷度を算出し、健常者と比較し有意に変動しているタンパク質スポットを選択する。クマシーブリリアントブルー（CBB）染色を行った同一のスポットを回収し、飛行時間型質量分析装置(TOF/TOF-MS)とデータベースを用いて個々のタンパク質を明らかにする。あわせて、有効な早期アルツハイマー病治療薬の検討も行う。
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