| 研究課題/領域番号 |
19H04209
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| 研究機関 | 青山学院大学 |
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研究代表者 |
諏訪 牧子 青山学院大学, 理工学部, 教授 (30242241)
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| 研究分担者 |
佐藤 主税 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (00357146)
池田 修己 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 情報・人間工学領域, 主任研究員 (20415772)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ビジュアルプロテオミクス / 膜タンパク質 / 電顕写真 / 立体構造 |
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| 研究実績の概要 |
2019年度は、以下のように当初の計画以上に進展した内容になった。
【課題1】公共DBのPDB，PDBTM中の膜タンパク質の立体構造を収集し，膜に垂直方向に原子座標を投影して疑似電顕画像化した。これら生物学的情報を付加してライブラリー化した。この中には膜タンパク質209種の353,674枚の画像を収納し、当初目標を超えた充実したDBになった。 【課題2-1】骨格筋の小胞上でカルシウムポンプを発現させた細胞膜画分に対し負染色法やクライオ電顕法で撮影する際の倍率やコントラストを最適化し、最適な撮影条件を決定した。これにより本研究で、画像照合のリファレンスとなる画像を大量に撮影できるようになった。当初の目標よりも進んだ内容である。
2020年度は、上記を継続するとともに、以下の2課題に取り組む。
【課題2-2】実際の生体膜上で画像照合するため、電顕画像全体から個々のタンパク質画像を切り出す技術を開発する。課題2-1で得た画像から輪郭を鮮明化したタンパク質像を得、膜面に垂直な軸に対する傾きが異なる複数画像にクラスター化する。これらを学習セットにし、深層学習を用いて、新たなテストデータの膜画像上で、膜面に垂直な軸に対し特定の向きを向いた膜タンパク質像を切り出す手法を開発する。【課題2-3】立体構造の投影像を、単一分子の二次元電顕画像に照合し、その膜タンパク質の種類を推定する方法を開発する。公共のDB（EMDB）中の二次元電顕画像および課題2-2で様々な角度でクラスター化された画像を学習セットとする。課題1のDB中の立体構造投影像と傾き多型集団画像に対し形の特徴量、膜面投影の原子集積度を計算し、立体構造投影像と学習セット画像間で照合する。深層学習手法も照合に応用する。電顕画像に対応する立体構造が無い場合は、配列から立体構造を予測し、電顕画像に照合する手法を開発する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
2019年度は、当初計画してい課題1と課題2-1に取り組んだ。
【課題1】全膜タンパク質構造・機能統合DBの構築：まず，公共DBであるPDB，PDBTM，Swiss-Protのいずれにも存在する条件で膜タンパク質の立体構造を収集し，ファミリー，サブファミリー，単体/複合体， 生物種などの情報を付加してライブラリー化した．各座標に対しては，膜表面の垂直方向（PDBTMに記載）や，一定の傾きの方向に投影したCα炭素の原子集積度から輝度を算出し疑似電顕画像を作成し，その形状を面積，周囲長，円形度，凹凸度，針状度の特徴量で表した．疑似電顕画像ライブラリー中には 353,674 枚の画像を収納した．内訳は，約6割が複合体であり，209の膜タンパク質ファミリーを含んでいた．また哺乳類を含む真核生物のデータが53％含まれている。この格納数は、当初目標の収納数を超え、機能推定ライブラリーとして大変充実したものになった。
【課題２－１】リファレンス膜画像によるパラメータチューニング：佐藤グループでは、骨格筋の小胞を対象にし、細胞膜画分を負染色法やクライオ電顕法で撮影する際、倍率を最適化し、コントラストのCTF補正を行う際に最適な撮影条件を決定できた。今後骨格筋の小胞上でカルシウムポンプなどの膜タンパク質のみを発現させた細胞膜画分を負染色法やクライオ電顕法リファレンスとなる画像を大量に撮影しすることが可能になった。これは、当初の目標よりも進んだ内容である。（大量の撮影画像は、slackを用いで共同研究グループ内で共有することになった。）
以上の理由から評価としては、（1）当初の計画以上に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
2020年度は、課題1と課題2－１を引き続き継続するとともに、新たに以下の2つの課題に取り組む。
【課題2-2】 実膜電顕画像からの分子像切り出し：実際の生体膜上で画像照合を応用するため、電顕画像全体から個々のタンパク質の画像を切り出す技術を開発する。課題2－1において複数のリファレンス画像から輪郭を鮮明化したタンパク質像を大量に得、自己組織化マップなどの方法で膜面に垂直な軸に対する傾き角度が異なる複数の画像にクラスター化する。これらの画像を学習セットにして、畳み込みニューラルネット法（CNN）などの深層学習を用いることで、新たなテストデータの膜画像上で、膜面に垂直な軸に対し特定の向きを向いた膜タンパク質像を切り出す手法を開発する。
【課題2-3】 単一電顕画像との照合：立体構造の投影像を、単一分子の二次元電顕画像に照合して、その膜タンパク質の種類を推定する方法を開発する。まず、公共の電顕画像データベース（EMDB）に登録された二次元電顕画像および課題2-2で様々な角度でクラスター化され切り出された画像を学習セットとする。課題1のDB中の立体構造投影像とその傾き多型集団および学習セットの画像に対し特徴量（面積、円形度、周囲長など）、周囲の輪郭波形、膜面に投影した原子集積度（輝度で表示）などを計算し、立体構造投影像、傾き多型集団と学習セットの画像間でこれらの相関係数を類似度として照合する方法を開発する。さらに畳み込みニューラルネット法（CNN）などの深層学習手法も照合に応用する。
電顕画像に対応する立体構造が無い場合は、配列情報を用いた照合を試みる。まず配列から膜貫通へリックス領域を予測して計算機上で仮想ヘリックスを巻き、電顕画像の形状や、へリックス軸間距離、傾き角度などを束縛条件にしながら最適配置する手法を開発する。
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