研究課題/領域番号 |
19H04269
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研究機関 | 大阪大学 |
研究代表者 |
中田 慎一郎 大阪大学, 高等共創研究院, 教授 (70548528)
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研究分担者 |
宇井 彩子 東北大学, 加齢医学研究所, 准教授 (00469967)
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研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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キーワード | DNA損傷応答 / ユビキチン |
研究実績の概要 |
RNF8・RNF168依存的なDNA2本鎖切断(DSB)応答における分子機構の詳細を研究するために、DSBシグナリングをDNA損傷非依存的に解析するための手法を開発した。 ゲノム中に96個連続したTRE(Tet responsible element)を組み込んだU2OS細胞に対し、TetR-mCherry-RNF8融合遺伝子を発現させ、RNF8をTREx96に局在(テザリング)させ、局所のユビキチン化依存的な応答を検証するシステムである。まず、一過性発現によりシステムが想定通りに機能することを確認の上、薬剤誘導性にRNF8を核移行させるシステムに発展させ、最終的には、発現ベクターをゲノムに組み込むという順でシステムの開発を進めることとした。 当初、TetR-mCherry-RNF8の発現により、mCherryのfoci(TREx96に局在したRNF8)と共局在する結合型ユビキチン(FK2抗体により染色される)のfoci、およびRNF168のfoci形成が蛍光免疫染色により確認された。一方、TetR-mCherryのみの発現では、mCherryのfociと共局在する結合型ユビキチンやRNF168のfoci形成は非常に弱く、実験系が予定通り機能していると予想された。しかし、RNF8の核内への誘導を薬剤誘導性(Tam誘導性)にデザインを変更した際、TetR-mCherry RNF8がTam非依存的に核内にfoci形成してしまい、また、TetR-mCherryのみでもTam非依存性にmCherryが核移行してしまうことが判明した。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
上記の問題に対し、核移行シグナルとなりうる配列を除去する等の改良を加えたものの、依然として、TetR-mCherryのみでもTam非依存性にmCherryが核移行してしまう状況が改善されなかった。このため、RNF8をTREx96に誘導する実験を精密に実施することが不可能となった。
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今後の研究の推進方策 |
TetR-mCherry発現ベクターの再構築を行う。具体的には、TetR, mCherry、RNF8の順を変更する。これにより、mCherry-RNF8をTam誘導性にTREx96に局在させ、ユビキチン化依存シグナルの分子機構を解析する。引き続き、シグナリングのATM依存性・MDC1依存性等ににつき解析を行っていく。
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