| 研究課題/領域番号 |
19H04445
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
堺 裕輔 九州大学, 工学研究院, 助教 (10608904)
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| 研究分担者 |
江口 晋 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (80404218)
中澤 浩二 北九州市立大学, 国際環境工学部, 教授 (00304733)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 肝細胞 / 内皮細胞 / 胆管 / 類洞 / 肝再生医療 |
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| 研究実績の概要 |
細胞の立体組織化は再生医療や薬物代謝アッセイ等に有望なアプローチであるが、複雑多岐な構造・機能を持つ肝臓の再構築は困難を極めている。本研究では、秩序立った肝小葉構造を再現するため、初代肝細胞、類洞内皮細胞、胆管細胞を立体配置して“効率的な物質交換を実現する肝細胞／類洞索状構造”と“胆汁排泄を担う胆管”を作製ことを目的とする。
NC型微細加工機を利用し、孔貫通型シリコーンフィルム（Multi-Pored Silicone Film; MPSF）鋳型を作製した。MPSFを貼り付けた温度応答性培養皿にPtスパッタリング及びPEGを修飾し、格子状の細胞接着培養機材を作製した。モデル細胞であるHUVECを接着させた後に内皮細胞を支持するヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）を共培養すると、HUVECは凝集して格子状に配列した。温度を低下させて組織形成すると、管腔様構造を有する内皮細胞ネットワークを形成し得た。
ラット初代成熟肝細胞を低分子化合物（ROCK阻害剤、TGF-β阻害剤、GSK3阻害剤）で肝前駆細胞（Chemically-induced Liver Progenitors; CLiP）にリプログラミングした。特に、従来の報告よりも5倍の高密度（5.0×10^4 cells/cm^2）で培養してCLiPを作製すると、胆管細胞への分化誘導多効率的に行われた。胆管マーカーであるAqpやCftrの発現も上昇し、胆管特有の機能を有していることが明らかとなった。肝細胞と培養胆管を共培養すると、CLF（肝細胞に取り込まれ毛細胆管に排泄される胆汁酸様蛍光試薬）が肝毛細胆管から胆管に移動することを明らかにし、小管の機能的な接合が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2019～2020年度は、①肝細胞／類洞内皮細胞索状配列・三次元培養、②リプログラミングを応用した胆管誘導、の2つを大きな目的とした。①は内皮細胞のネットワークを作製することに成功し、肝細胞を複合する直前まで来ている。②はおおよそ想定通りに進捗した。一方、2019年度は所属大学の異動により研究基盤の整備に時間を要したこと、臨床研究倫理申請の承認遅延が原因で、さらなる進展は困難であった。
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| 今後の研究の推進方策 |
019年度と同様に、①肝細胞／類洞内皮細胞索状配列・三次元培養、②リプログラミングを応用した胆管誘導、を中心に研究を推進する。2019年度に作製した孔貫通型シリコーンフィルム利用して肝細胞／類洞内皮細胞のパターニング組織を開発する。より確実なパターニング技術を確立するため、Pt-チオール結合による分子修飾を実施する。研究分担者である中澤浩二教授（北九州市立大学）と共に実施する。さらに、肝類洞内皮細胞を利用して同様にパターニングとシート状の組織体を形成できることを明らかにする。共焦点レーザー走査型顕微鏡等を用い、Calcein-AM/PI染色によるLive/dead、細胞トレーシング試薬（Cell Tracker等）による肝細胞と内皮細胞の遊走を評価する。ヒト初代肝細胞及び類洞内皮細胞は、手術検体から調製する。研究分担者である江口晋教授（長崎大学）が患者選定と同意書取得、細胞調製結果の解析を実施する。
培養胆管と上述で作製する肝細胞／類洞内皮細胞索状組織を共培養し、肝細胞／類洞内皮細胞（類洞）／胆管細胞（胆管）配列組織（Arranged-Hepatocytes/liver sinusoidal Endothelial cells/Cholangiocytes Tissues; A-HECT）を作製するとともに、肝毛細胆管と胆管の接合に取り組む。免疫染色等を利用して、肝毛細胆管（MRP2）と胆管（CK19）が構造的に接合しているかを評価する。TEMを用い、更に詳細に細胞間接着結合等の微小構造解析を行う。CLF取り込み評価により、肝毛細胆管に排泄された蛍光試薬が胆管に移動することを明らかにする。落谷孝広教授（東京医科大学医学総合研究所）の協力を得て実施する。
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