| 研究課題/領域番号 |
19H04461
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
赤坂 司 北海道大学, 歯学研究院, 准教授 (00360917)
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| 研究分担者 |
横山 敦郎 北海道大学, 歯学研究院, 教授 (20210627)
吉村 善隆 北海道大学, 歯学研究院, 准教授 (30230816)
牛島 夏未 北海道大学, 歯学研究院, 技術専門職員 (40374558)
宮治 裕史 北海道大学, 大学病院, 講師 (50372256)
星 淡子 前橋工科大学, 工学部, 准教授 (50399812)
加我 公行 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 講師 (50824083)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | マイクロ・ナノパターン / 骨芽細胞 / 破骨細胞 / 動物埋入試験 / 超立体階層化パターン / 歯根膜再生 |
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| 研究実績の概要 |
●研究の目的：
バイオ系（超立体）微細パターン作製技術を用い、①微細パターンと各種歯周組織細胞の網羅的評価による効果の法則化、②歯根膜構造をさらに効率的に再生する超立体階層化パターンの創製を目指す。
●研究の成果：
①モールド作製：標準パターンでは、広範囲の形状・サイズのパターンとプラズマ処理にて、スクリーニングアッセイが容易となった。超微細構造では、3Dプリンター製羽根突きピラーの凸構造モールドでは転写時の破損が多かったが、凹構造やテーパー形デザインに変更することにより、破損を減らすことができた。
②細胞培養：主に破骨細胞と骨芽細胞に対する凹凸による促進効果の機能解明の足掛かりとなる検討を行った。骨芽細胞に関して、サイズや形状に加え、高さの接着斑形成への影響を調べた結果、高さの効果は大きく、高いとパターン上部で接着斑形成が弱くなる傾向が観察された。これは細胞が認識する基準面の違いや柔軟性などが関与していると推測される。破骨細胞に関しては、前駆細胞の由来による凹凸の認識の違いを検討したところ、由来に関係なく似たサイズ・形状を好む傾向を示した。しかし、親水疎水に関しては骨髄由来の前駆細胞では疎水性を好むが、RAW264.7だと親水性を好む傾向が観察された。また、カルシウムオシレーションの観察では、単核破骨細胞の形成段階ですでに凹凸の効果が寄与することが判明した。このことは機能解明に繋がる。
③動物実験：ピラーおよびホールパターン化フィルム（直径1μm or 5μm、高さ5μm）をマウス大腿骨に埋入し、１週間後と4週間後に組織観察とTEM観察を行った。ピラーおよびホールにて直径1μmでは石灰化が促進された。特にホール直径1μm、深さ5μmで細胞やコラーゲンの入り込みが観察されたとともに、コラーゲン線維の配向も観察された。パターンにより配向した組織再生の可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本課題の計画をおおまかに分けると、①微細パターンと各種歯周組織細胞の網羅的評価による効果の法則化、②歯根膜構造をさらに効率的に再生する超立体階層化パターンの創製である。
本年度に主に検討した細胞の種類は骨芽細胞や破骨細胞であり、パターンのサイズおよび濡れ性・表面組成の関係に法則を見出している。しかし、骨芽細胞や破骨細胞の由来によっても効果が少し異なることが分かったため、細胞の種類を増やした検討が必要となった。そのため法則化の進行が遅れている。
また、②のモールド作製での難易度の高い超立体階層化パターンの検討では、超微細3Ｄプリンターの使用により、目的精度内でパターンモールドの作製およびCOPへの形状転写を達成することができた。しかし、その際には予想以上に困難であったためトライ＆エラーを複数回繰り返すことになり、アッセイが遅れぎみとなってしまった。
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| 今後の研究の推進方策 |
本課題の計画をおおまかに分けると、①微細パターンと各種歯周組織細胞の網羅的評価による効果の法則化、②歯根膜構造をさらに効率的に再生する超立体階層化パターンの創製である。
●モールド作製に関して：標準パターンに関しては、現在の基準的なパターン作製の継続実施に加え、アパタイトやコラーゲンパターンを作製し、材質検討アッセイに使用する。超立体階層化微細パターンに関しては、既に作製プロセスは決定しているので、培養アッセイ→結果のデザインへのフィードバックを繰り返し、デザインの最適化を進める予定である。
●細胞培養に関して：ヒト歯根膜線維芽細胞の法則化が見えて来ているので、さらに検討を進め、明白な法則化を目指す。また、骨芽細胞や破骨細胞に関しては法則化が出来ているので、凹凸効果の機構解明（なぜ効果がでるのか）につながる検討を行いたい。その際、各種抗体による接着斑や重要タンパク質の免疫蛍光観察、Western blotやリアルタイムPCR、SEMおよびTEMによる断面観察なども検討し、機構解明へ繋げる。
●動物実験に関して： 歯根膜再生を念頭に置き、標準パターンであるピラーやホールの埋入試験を行い、コラーゲンの配向に着目した組織観察やTEM観察を行う。また、超立体階層化微細パターンに関しても、最適化後、動物埋入試験を行い、同様な観察方法により細胞の配向やコラーゲンの配向を中心に検討したい。
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