| 研究課題/領域番号 |
19H04466
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
玉田 靖 信州大学, 学術研究院繊維学系, 教授 (70370666)
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| 研究分担者 |
塩見 邦博 信州大学, 学術研究院繊維学系, 准教授 (70324241)
小林 尚俊 国立研究開発法人物質・材料研究機構, 国際ナノアーキテクトニクス研究拠点, 上席研究員 (90354266)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | シルク / 表面分析 / 遺伝子組換え / 細胞評価 |
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| 研究実績の概要 |
シルクフィブロインフィルム上での細胞移動性評価について、フィルム作製後の後処理による移動性の変化について評価したところ、フィブロインフィルム不溶化処理であるメタノール処理において、メタノール濃度を変化させたフィルム上での細胞移動性を評価すると、70％濃度処理に比較して90％濃度処理の表面上では優位に細胞移動性が低下することが確認された。アルコール処理濃度によるシルクフィブロンフィルム表面構造の変化を大気中および液中AFMによる観察を試みたところ、大気中においてアルコール濃度が高いほど表面凹凸が大きくなる傾向が観察され、また液中観察においては大気中よりもより表面凹凸が小さく観察された。しかし、液中観察においてはカンチレバーの条件が適切でなかったため、今回得られた経験からシルク材料表面の液中AFM観察に適切なカンチレバーを選定した。また、大気中観察ではあるが、スピンコートとキャストコートによりフィブロインフィルム表面構造も異なることも観察されたため、コーティング手法による表面物性の相違が推定された。また、これらの細胞移動性が変化した各フィブロインフィルム上で培養した細胞のRNA-saqのための試料調製を進め、分析が可能な状態の遺伝子試料が調製できたため、次年度にRNA-seq解析の準備ができた。
シルクフィブロイン分子の力学物性の改変のために、昨年度作出したフィブロイン分子のN末端を欠損した遺伝子組換えカイコの繭からフィブロイン繊維を抽出し、その単繊維の力学物性を評価した。遺伝子組換えの繭の繭層率が低く試料調製が困難であったが、得られた精錬絹糸についての構造解析から、フィブロインの2次構造には大きな変化がないが結晶構造の若干の変化が観察され、また物性測定から、野生型シルクに比較し組換えシルクの引っ張り弾性率の低下や動的粘弾性結果によるガラス転移温度の低下が観察された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度まで検討をしていたCPフラクション混合系においては、溶媒系の相違から混合によるフィルム状態の再現性に乏しいことが判明したため、他の材料調製法の検討を進めたところ単純なコーティング手法や後処理手法の相違により、フィブロインフィルム上での細胞移動性が有意に変化することを見いだし、それらの表面の構造分析を大気中および液中AFM手法を用いて検討し、細胞移動性の変化に対応して表面構造の変化が存在することを明らかにした。しかし、コロナ禍により共同研究者の機関での共同研究が十分にできなかったため予定した各フィブロインフィルムの表面弾性率の定量化までは進めなかったが、本課題で重要な測定手法である液中AFM分析での課題が明らかになり、その対応に着手できた。
調製法が異なるフィブロインフィルム上で培養した細胞の遺伝子解析では、RNA-seq分析のための遺伝子試料調製を行い一部機器の不調があり調製に時間がかかったが、本年度内にRNA-seqが可能な状態の遺伝子試料が調製できた。
遺伝子組換えシルクの作出については、結晶領域の変異を目指した遺伝子組換えについては遺伝子の設計を進めたが適切な挿入場所等で設計が難しいために、設計指針等の再検討が必要であることが分かった。一方、フィブロインN末端欠損シルクについては、昨年度作製した遺伝子組換えカイコにより繭の産生に成功し、繭からのフィブロン繊維の抽出と単繊維の構造や物性の評価を実施し、野生型と比較して結晶構造や引っ張り弾性率が変化していることを見いだし、フィブロイン材料表面の構造や物性を変化させることが可能であることが分かった。次年度に遺伝子組換えシルクによるフィルム化と細胞移動性評価や表面物性分析のための準備ができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度までに絞り込んだシルクフィブロインフィルムの調製法（コーティング法および後処理法）によりフィブロインフィルムを調製し、その表面構造と表面物性を詳細に分析する。特に、表面物性については表面弾性率の局所的な変化やその分布がフィブロイン上での細胞移動性の高さに影響していると推察しているため、昨年度選定したカンチレバー等の条件により液中測定によるそれぞれの表面の弾性率を定量化と表面での局所的な違いの有無について検討を行う。また、2次構造の局所的な変化についても顕微ラマンによる液中測定と解析を試みる。
昨年度細胞移動性が異なる細胞からの遺伝子試料の調製が終わった試料について、RNA-seqを実施する。得られた結果を解析し、細胞移動性との関連が考えられる遺伝子については、定量PCR法を用いて、経時的な遺伝子発現量の変化について測定する。
遺伝子組換えシルクでは、昨年度までに作出したN末端欠損フィブロインによるフィルムを作製し、細胞移動性の評価を行うとともに、液中AFM等での表面構造や物性の分析を行い、細胞移動性と表面構造との関連について解析する。
本研究課題の最終年度となるため、上記の結果を含め本年度までに得られた結果を総合的に判断し、細胞移動性を与えるフィブロイン材料表面の構造や物性をまとめ、細胞移動性の大きく異なる2つのフィブロイン材料表面を作製し、心筋細胞や皮膚細胞を用いて、それらの分化促進効果や組織再生効果の有無についての評価を実施する。
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