• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 課題ページに戻る

2019 年度 実績報告書

二重特異性抗体を用いたBNCTホウ素デリバリーシステムの開発

研究課題

研究課題/領域番号 19H04472
研究機関大阪市立大学

研究代表者

長崎 健  大阪市立大学, 大学院工学研究科, 教授 (30237507)

研究分担者 中西 猛  大阪市立大学, 大学院工学研究科, 准教授 (20422074)
増永 慎一郎  京都大学, 複合原子力科学研究所, 教授 (80238914)
立花 太郎  大阪市立大学, 大学院工学研究科, 教授 (80311752)
研究期間 (年度) 2019-04-01 – 2023-03-31
キーワードホウ素中性子捕捉療法 / 抗体 / 二重特異性抗体 / ドラッグデリバリー
研究実績の概要

BSHをEMCS(N-マレイミドカプロイルオキシスクシイミド)架橋剤を介してBSAとコンジュゲーション化した。これを抗原としてラビットに免免疫後、脾臓由来のリンパ球を採取し、シングルセルピッキングにより、BSHに特異的な抗体を産生するリンパ球を8個得た。それらのリンパ球由来のBSH抗体遺伝子を組み込んだベクターをHEK293T細胞にトランスフェクションし、培養上清で行ったELISAでは2つのクローンにおいて陽性反応が示された。作製した抗BSH抗体を用いた免疫染色の結果より、抗BSH抗体が細胞内でBSHへ結合することを確認した。抗BSH抗体Fabを用いた、SPR法による抗BSH抗体のKD値は4.02×10-7 Mであった。
さらに、作製したラビット抗BSH抗体軽鎖可変領域遺伝子にヒト抗体CL領域遺伝子を連結した二重特異性抗体軽鎖発現ベクターを構築した。ラビット抗BSH抗体重鎖可変領域遺伝子を、Her2結合部位遺伝子を含む発現ベクターに組込み、二重特異性抗体重鎖発現ベクターを構築した。そして、作製した二重特異性抗体発現ベクターを用いて、BSHとHer2に対する二重特異性抗体を作製し、ELISA評価によりBSHへの結合能を確認した。フローサイトメトリー評価では、Her2陽性細胞としてSKBR3細胞、Her2陰性細胞としてNIH3T3細胞を用いて評価を行い、作製した二重特異性抗体がSKBR3細胞への特異的結合が確認できた。これらの結果より、作製した二重特異性抗がHer2発現がん細胞へのBSH送達に有効である可能性を見出した。
作成した二重特異性抗体のin vivoでのHer2発現腫瘍細胞への集積を評価するために、SKBR3担がんマウスの作製を種々検討したが、現在のところ成功には至っていない。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

BSH 修飾BSAをラビットに免疫し、水溶性のホウ素薬剤であるBSHに対する抗体を作製し、ラビットに免役し、抗BSH抗体の作製に成功した。その抗体遺伝子を用いることで、BSHとHer2に対する二重特異性抗体を作製し、更にBSHとHer2に対する結合能を評価確認した。そして、その抗体遺伝子を用いて作製した二重特異性抗体において、BSHとHer2のそれぞれに結合することが確認でき、がん細胞選択的なホウ素薬剤送達ツールとしての大きな可能性が示唆された。それらの成果のうち、一部は第41回日本バイオマテリアル学会「優秀研究ポスター賞」を受賞し、高く評価を受けることができた。

今後の研究の推進方策

作成した二重特異性抗体のin vivoでのHer2発現腫瘍細胞への集積を評価するために、SKBR3担がんマウスの作製を種々検討したが、現在のところ成功には至っていない。皮下移植の際にハイドロゲルを使用することや、他のHer2発現乳がん細胞(SKOV3細胞)、またマウスもBalb/c SCIDマウスやKSNマウスなどを検討し、動物モデルの作成を行う。
Her2抗原ヒト乳がん移植モデルの作製が困難な場合、前臨床試験を遂行できなくなるので、Her2以外のがんに対する抗原蛋白としてEGFRを認識する二重特異性抗体の作製を行う。中西らによって作製されたCD3とEGFRに対する二重特異性抗体の重鎖発現ベクターの可変領域を抗BSH抗体の可変領域に変えることによってBSHとEGFRに対する二重特異性抗体発現ベクターを作製する。Expi293F細胞へトランスフェクションを行い、抗体を発現させ、SDS-PAGEで発現の確認行う。抗BSH/EGFR二重特異性抗体の抗原BSHとEGFRへの結合特性を評価する。

  • 研究成果

    (8件)

すべて 2020 2019

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 1件)

  • [雑誌論文] Preparation and Characterization of a Novel Bispecific Antibody That Targets Her2 and BSH for Boron Neutron Capture Therapy2020

    • 著者名/発表者名
      Taisei Kanai, Taro Tachibana, Takeshi Nakanishi, Mitsunori Kirihata, Yoshihide Hattori, Yu Sanada, Yoshinori Sakurai, Shin-ichiro Masunaga
    • 雑誌名

      KURNS Progress Report 2019

      巻: - ページ: -

  • [雑誌論文] Turn-on fluorescence and photodynamic activity of β-(1,3-1,6)-d-glucan-complexed porphyrin derivatives inside HeLa cells2019

    • 著者名/発表者名
      Hino Shodai、Funada Rikushi、Sugikawa Kouta、Koumoto Kazuya、Suzuki Toshio、Nagasaki Takeshi、Ikeda Atsushi
    • 雑誌名

      Photochemical & Photobiological Sciences

      巻: 18 ページ: 2854~2858

    • DOI

      10.1039/C9PP00208A

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Improved Stability and Photodynamic Activity of Water‐Soluble 5,15‐Diazaporphyrins Incorporated in β‐(1,3‐1,6)‐ d ‐Glucan with On‐Off Switch2019

    • 著者名/発表者名
      Hino Shodai、Satake Shuhei、Shinmori Hideyuki、Kawabata Shigeki、Koumoto Kazuya、Suzuki Toshio、Nagasaki Takeshi、Sugikawa Kouta、Kawasaki Riku、Ikeda Atsushi
    • 雑誌名

      Chemistry ? An Asian Journal

      巻: 15 ページ: 365~370

    • DOI

      10.1002/asia.201901582

    • 査読あり
  • [学会発表] ホウ素中性子捕捉療法用新規ホウ素薬剤送達ツールとしての二重特異性抗体の抗原認識能2020

    • 著者名/発表者名
      金井大成、立花 太郎、中西 猛、長崎 健
    • 学会等名
      京都大学複合原子力科学研究所第54回学術講演会
  • [学会発表] コウジ酸はがん幹細胞標的化に使えるか?2019

    • 著者名/発表者名
      長﨑 健、堂脇聖史、河崎陸
    • 学会等名
      第22回生命化学研究会
  • [学会発表] ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)におけるホウ素薬剤送達に用いる二重特異性抗体の作製2019

    • 著者名/発表者名
      金井大成、立花 太郎、中西 猛、長崎 健
    • 学会等名
      第13回バイオ関連化学シンポジウム
  • [学会発表] Cellular uptake mechanism of kojic acid modified o-carborane as a boron drug toward melanoma-targeting BNCT2019

    • 著者名/発表者名
      Takeshi Nagasaki, Satoshi Dowaki , Riku Kawasaki , Koki Matsuura , Yoshihide Hattori, Yoshinori Sakurai, Shin-ichiro Masunaga, Mitsunori Kirihata
    • 学会等名
      10th Young Researchers BNCT Meeting
    • 国際学会
  • [学会発表] ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)におけるホウ素薬剤送達用二重特異性抗体の作製と機能評価2019

    • 著者名/発表者名
      金井大成、立花 太郎、中西 猛、長崎 健
    • 学会等名
      第41回日本バイオマテリアル学会

URL: 

公開日: 2021-12-27  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi