| 研究課題/領域番号 |
19H04472
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
長崎 健 大阪市立大学, 大学院工学研究科, 教授 (30237507)
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| 研究分担者 |
増永 慎一郎 京都大学, 複合原子力科学研究所, 教授 (80238914)
中西 猛 大阪市立大学, 大学院工学研究科, 准教授 (20422074)
立花 太郎 大阪市立大学, 大学院工学研究科, 教授 (80311752)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ホウ素中性子捕捉療法 / 二重特異性抗体 / 腫瘍集積 / EGFR / インビボイメージング / 担がんマウス / デンドリマー |
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| 研究実績の概要 |
前年度までに、ホウ素クラスターBSHとがん抗原Her2に対する二重特異性抗体の作製に成功したが、Her2高発現SKBR3細胞担がんマウスの作製には至っていない。そこで、中西らによって作製されたCD3とEGFRに対する二重特異性抗体の重鎖発現ベクターの可変領域を抗BSH抗体の可変領域に変えることによってBSHとEGFRに対する二重特異性抗体発現ベクターを作製した。Expi293F細胞へトランスフェクションを行いSDS-PAGEによりBSHとEGFRに対する二重特異性抗体の発現を確認し精製した。またBSHを抗原としたELISA評価を行った結果、作製したBSHとEGFRに対する二重特異性抗体はBSHへの結合能を有していることが分かった。BSHとEGFRに対する二重特異性抗体がEGFR過剰発現がん細胞であるA431細胞において内部移行性を示すのか確認を行うために、pH感受性蛍光物質（pHrodo）標識BSH-EGFR二重特異性抗体を調製した。細胞表面に結合したpHrodo標識BSH-EGFR二重特異性抗体が24時間後細胞内に取り込まれてエンドソーム／リソソームに輸送されることを確認した。また、A431細胞をBalb/cヌードマウスの後肢大腿部皮下に移植したところ、定量的に担がんマウスの作製に成功した。担がんマウスに蛍光標識BSH-EGFR二重特異性抗体(50 μg分)腹腔内投与後、インビボイメージング装置VISQUER In Vivo Smart-LFを使用し検出フィルターICGで検出したところ、二重特異性抗体の腫瘍組織への集積を確認した。また、BSH集積ホウ素薬剤として、これまでのBSH-EMCS-BSAの他に、第４・５世代PAMAMデンドリマーへEMCSを架橋剤としてBSHを導入し、BSH修飾PAMAMデンドリマーの調製に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度までに、ホウ素クラスターBSHとがん抗原Her2に対する二重特異性抗体の作製に成功した。しかし、Her2高発現SKBR3細胞の移植担がんマウスの作製には至っていない。そこで、中西らによって作製されたCD3とEGFRに対する二重特異性抗体の重鎖発現ベクターのCD3に対する可変領域を抗BSH抗体の可変領域に変えることによってBSHとEGFRに対する二重特異性抗体発現ベクターを作製した。BSHとEGFRに対する二重特異性抗体を発現させ精製した。SDS-PAGEによりBSHとEGFRに対する二重特異性抗体の発現を確認した。またBSHを抗原としたELISA評価を行った結果、作製したBSHとEGFRに対する二重特異性抗体はBSHへの結合能を有していることが分かった。作製したBSHとEGFRに対する二重特異性抗体がEGFR過剰発現がん細胞であるA431細胞において内部移行性を示すのかの確認を行うために、pH感受性蛍光物質（pHrodo）標識BSH-EGFR二重特異性抗体を調製した。細胞表面に結合したpHrodo標識BSH-EGFR二重特異性抗体が細胞内に取り込まれて発光しエンドソーム／リソソームに輸送されることを確認した。担がんマウスに近赤外蛍光標識BSH-EGFR二重特異性抗体(50 μg分)腹腔内投与｛VISQUER In Vivo Smart-LFを使用し、検出フィルターICGで検出したところ、24時間後から二重特異性抗体の腫瘍組織への集積を確認した。
また、第４・５世代PAMAMデンドリマーへEMCSを架橋剤としてBSHを導入し、BSH修飾PAMAMデンドリマーの調製に成功した。
これの成果は学会発表等の予定が、COVID-19の影響出学会開催がキャンセルされ、発表に至らなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
in vivo においてBSH-EGFR二重特異性抗体のA431細胞移植担がんマウスにおける腫瘍集積が確認されたので、次にBSH集積ポリマーの逐次的な腫瘍集積をインビボイメージングにて評価する。BSH集積ポリマーとしてBSA誘導体のほかBSHの修飾数を制御し易いPAMAMデンドリマー（第４、第５世代）を基体とするBSH修飾PAMAMデンドリマーを用いて、担がんマウスでのホウ素デリバリー能を評価する。腫瘍組織への集積最適条件を確認後、京都大学複合原子力研究所にて中性子照射実験を行い、BSH-EGFR二重特異性抗体を用いた細デリバリーシステムのBNCT効果を評価する。また、Her2発現細胞として、SKNR3細胞の他に、SKOV3細胞を用いた担がんマウスモデルの作製も検討し、担がんマウスを作製後、BSH-Her2二重特異性抗体を用いた細デリバリーシステムのBNCT効果を評価する。
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