| 研究課題/領域番号 |
19H04498
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| 研究機関 | 同志社大学 |
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研究代表者 |
秋山 いわき 同志社大学, 生命医科学部, 教授 (80192912)
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| 研究分担者 |
池川 雅哉 同志社大学, 生命医科学部, 教授 (60381943)
市川 寛 同志社大学, 生命医科学部, 教授 (60336732)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | メダカ胚 / プロテオーム解析 / 網羅的解析 / 酸化ストレス / サルコペニア / 骨格筋細胞 |
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| 研究実績の概要 |
母体を介した胎児への超音波照射の影響は、安全性の担保の面から重要な問題である。我々は, メダカ（Oryzias latipes）を用いた超音波照射の影響を観測するための解析システムを構築してきた。メダカは、小型淡水魚であり，飼育が容易，多産，短い世代サイクルといった遺伝学に適した実験系である。また発生期の超音波影響を見る上でメダカ胚は透明で観察しやすい.メダカはゼブラフィッシュより発生速度が緩やかであるため，胎児期の影響を観察しやすいなど優れた特長を有している．本研究では，タンパク質レベルでの超音波照射の生体影響を検証するため１メダカ胚から抽出した試料を対象に網羅的定量プロテオミクスのひとつであるデータ非依存的に網羅的MS/MSを取得するSWATH （Sequential Window Acquisition of all Theoretical fragmention spectra）解析という網羅的プロテオーム解析を行い、超音波照射によりメダカ胚プロテオーム・プロファイルの変動を見出した．
一方、超音波照射が、「酸化ストレス」を介した機序でどのような影響を生体に及ぼすかを明らかにするために、以下のようなin vitroの手法を用いた。C2C12より分化させた骨格筋細胞に対し、外因性の過酸化水素（10~100μM）を15分間暴露させ、タンパク合成の指標となるpp70s6kおよび、およびタンパク分解の指標であるFOXO1、MuRF1をウェスタンブロッティング法により評価した。次に、骨格筋細胞に超音波照射した場合の、細胞内及び培地内に産生される活性酸素種を定量し、前述のタンパク合成増強、タンパク分解抑制の条件に一致する超音波照射条件を設定した。また、適切な超音波照射により増強したタンパク合成が、各種抗酸化物質により減弱することを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
SWATH解析を用いた１メダカ胚由来のタンパク質の網羅的解析の結果, ユニークなタンパク質として651種類、ペプチドを7186種類の同定に成功した. 発生期にこれらのタンパク質の発現に影響を及ぼす可能性が示唆された.また、骨格筋細胞への超音波照射は, 条件によって筋合成促進作用および筋萎縮抑制作用を持つことが示唆された. また、超音波照射によって培地中で発生する活性酸素種が筋管細胞の筋合成活性の促進に関与する可能性が示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
SWATH解析により，受精後4日目のメダカ胚に照射時間60 s，負音圧ピーク値を100，500，1000 kPa，非照射（0 Pa）と合わせて4サンプルを作成し4サンプルの各プロテオーム群間比較を行い, 照射胚では発現が抑制され非照射のメダカ胚において保存されているタンパク質としてHistone，Elongation Factor, Choriogenin由来ペプチドを検出した.今後は, その変動を担うタンパク質やペプチドの定量的解析やその効果としての代謝レベルでの変動を通じて超音波の安全性評価のマーカーとなりうる可能性について検証が必要であると考えられた.
超音波照射が、「酸化ストレス」を介した機序でどのような影響を生体に及ぼすかをあきらかにするために、引き続き以下のようなin vivoの手法を用いる。骨格筋細胞に動物実験としては、廃用性萎縮のモデルとして、ラット後肢テープ固定モデルを用いる。作成動物モデルは、無負荷条件（Control）とテープ固定（Casting）条件の２条件に分け、サージカルテープにより片側後肢の膝関節および足関節を1週間固定する。同時に、下肢への超音波照射の介入を行う。下肢屈筋群のうち、主に遅筋線維から構成されるヒラメ筋（Soleus ） 及び、主に速筋線維から構成される足底筋（Plantaris）を被験筋とし、筋を摘出後、速やかに筋湿重量を計測する。同時に、前述の骨格筋細胞実験における、タンパク合成指標のpp70s6kおよび、およびタンパク分解指標のFOXO1、MuRF1をウェスタンブロッティング法により評価し、超音波照射の筋萎縮に対する予防効果を証明する。
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