| 研究課題/領域番号 |
19H05647
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
佐甲 靖志 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (20215700)
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| 研究期間 (年度) |
2019-06-26 – 2024-03-31
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| キーワード | 受容体 / １分子計測 / 細胞内情報伝達 / 細胞膜 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、最新の１分子計測法などにより、ヒトの主要な膜受容体 (GPCR, RTK) のほぼ全ての分子種について近傍脂質を含めた機能・構造動態の計測・解析を行い、膜の自己組織化による機能制御機構を明らかにすることを目的とする。研究は下記４項目とそれらの統合的な解釈で構成される。本年度の進捗は以下の通りである。
１．膜受容体の細胞膜動態の網羅的な１分子計測:ヒトRTK53種中50種のクローニングを行い、蛍光蛋白質タグを結合してHEK293細胞に発現させ、リガンド刺激による活性化を細胞内カルシウム動態及びERK活性プローブによって計測した。さらに自動化細胞内１分子計測顕微鏡装置を使ってパイロット的な網羅的１分子計測を行い、十数種に関しては解析可能な１分子動態動画を得た。蛍光蛋白質標識法の問題が明らかとなり、改良法に取り組んでいる。
２．膜脂質と受容体の超解像可視化:３色PALM法によってRTKの一種EGFRとPS, PIP2の共局在計測を行い、受容とPIP2との共局在がPLC依存的に減少することを明らかにした。PIP2はEGFRのリン酸化活性を促進するが、PIP2との共局在はEGFRからの信号伝達を抑制する。
３．膜受容体の境界脂質の分析:細胞膜から特定受容体周りの脂質をSMAナノディスクとして切り出し、精製する方法を確立した。質量分析による脂質分析の準備を進めている。
４．再構成膜における膜受容体の脂質制御の解析:脂質組成を変化させた再構成ナノディスク膜での実験から、EGFRの膜貫通・膜近傍部位が酸性脂質、コレステロールさらに膜近傍部位のスレオニンリン酸化によって会合状態を変化させることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究はどの項目も概ね順調に進行している。RTK研究のプロトタイプと言えるEGFRの研究から、コレステロール、スフィンゴミエリンの作る膜ドメインとドメイン外を行き来することにより、受容体が２量体・多量体構造を選択し、機能発現していることが明らかになってきた。酸性脂質と受容体膜近傍のリン酸化が受容体の膜貫通・近傍の配向を制御して、脂質指向性を変化させているが、近傍の酸性脂質濃度やリン酸化は受容体自身の機能により自己制御されており、複雑かつ巧妙な自己組織化現象が情報処理機能をもたらしている (Hiroshima et al, submitted, Maeda et al, submitted)。EGFRに関しては本研究の目標に到達しつつあるといえる。一方、GPCRのひとつAT1RではG蛋白質シグナルとアレスチンシグナルのバイアスをもたらす分子機構が、細胞膜ドメインへの集積と関連して異なったGRKサブタイプによるリン酸化の違いであることを明らかにした (Kawakami et al, 2021)。いずれの受容体ファミリーも膜脂質環境とリン酸化の関わりが自己制御反応の鍵となっていることは機能制御の一般性を示唆している。
網羅的計測へ向けては、当初計画していた細胞質末端の標識がしばしば切断され細胞質で背景信号を高くすることが問題であることが明らかになった。これを回避するために細胞外部位での新たな標識法開発を進めており、試験計測で良好な結果が得られたために、網羅的標識化を行っている。全体としては十分な手応えを感じており、概ね順調な進行であると判断する。
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| 今後の研究の推進方策 |
2022年度は以下の様な研究計画で、各研究項目をさらに進捗・発展させる予定である。
１．膜受容体の細胞膜動態の網羅的な１分子計測:新規開発した細胞膜蛋白質の細胞外末端標識法により、RTK, GPCRの網羅的な１分子動態計測を行う。細胞質末端標識による従来法でデータが得られているRTKの受容体動態を明らかにする。これまでの結果では、多くの受容体やチャネル蛋白質においても活性化に伴う自己制御的な膜局在変化が示唆されている。この現象と分子機構の一般性を検証する。
２．膜脂質と受容体の超解像可視化:共同研究者が得た新規プローブ2種を利用して細胞膜内層・外層でのコレステロール分布と動態を、受容体と共に超解像計測する。網羅的な超解像計測を進め、種々のRTKと膜脂質(PS, PIP2, コレステロール）との共局在解析を進める。EGFRにおける予備的な結果は、階層的な膜ドメイン構造と受容体の相互作用が、入力によって動的に変化することを示唆している。この現象の一般性を検討する。
３．膜受容体の境界脂質の分析:膜蛋白質と直接相互作用する膜脂質を境界脂質と呼ぶ。細胞膜からERBB (EGFR family) 周りの脂質をSMAナノディスクとして切り出し、精製することに成功している。薄層クロマトグラフィーで主要な脂質種が同定できているが、質量分析法によって脂質ヘッドグループ及び脂肪酸種の詳細な同定を行い、入力前後での境界脂質の変化を明らかにする。また、SMAを化学修飾してガラス基板へ結合し、ナノディスク内での脂質１分子可視化計測を試みる。
４．再構成膜における膜受容体の脂質制御の解析:精製した受容体をMSPナノディスクに再構成し、脂質組成による構造・機能変化を１分子FRET法で計測する。ERBB受容体分子の再構成系を構築して、細胞外部でのリガンド結合と細胞質側での構造変化の共役機構を研究する。
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