| 研究課題/領域番号 |
19J11829
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
關場 一磨 東京大学, 大学院医学系研究科, 特別研究員(DC2)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-25 – 2021-03-31
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| キーワード | B型肝炎ウイルス / cccDNA / ウイルス-宿主相互作用 / 遺伝子編集 |
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| 研究実績の概要 |
B型肝炎ウイルス（HBV）複製の鋳型であるcovalently closed circular DNA（cccDNA）に付随して存在する蛋白群を網羅的に同定するために、本年度はまず、DNA切断能を持たないdeadCas9（dCas9）と距離依存性ビオチン化酵素BioID2との融合蛋白dCas9-BioID2とHBVの感染に必須なNTCP受容体とを共発現する細胞株を樹立した。このNTCP; dCas9-BioID2強制発現細胞でHBV感染系を再現可能か検討したところ、通常のNTCP強制発現細胞同様にHBV感染および複製が起こることが確認された。
次いで、dCas9-BioID2をcccDNAに近接させるためのguide RNAの設計をcccDNAの塩基配列を基に設計した。この設計したguide RNAの特異性を検証するために、DNA切断能のあるCas9発現細胞にHBV cccDNAを模倣するHBV Minicircle DNAをトランスフェクションした上で、guide RNAを導入し、cccDNA量が減少するかdroplet digital PCRで検討した。結果、設計guide RNA導入群で有意なcccDNA量の減少を認めたため、この設計したguide RNAがcccDNA配列を認識していることが示された。
そこで、これらのNTCP; dCas9-BioID2強制発現細胞とcccDNA用guide RNAを用いて、cccDNA近傍蛋白のビオチン化をし、ストレプトアビジンで沈降した。このサンプルに対し、抗ヒストンH3抗体でウェスタンブロットを行った結果、HBVの感染をさせたサンプルでのみヒストンH3のバンドが確認され、実験系が問題なく働いていることが示唆されたため、このサンプルを質量分析に提出し、現在解析中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の基盤となるNTCP; dCas9-BioID2強制発現細胞を作製できたことで、質量分析へのサンプル提出まで滞りなく行うことが可能だったことから、概ね計画通りに進んでいると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
質量分析により同定された蛋白に対する個別の抗体で免疫沈降し、cccDNAの共沈の有無をdroplet digital PCRで検証する。これによりcccDNAに結合していることが証明された蛋白については個別にノックアウトし、ウイルス産物量の変化を検証することで、同定蛋白の機能解析へとつなげていきたい。
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