| 研究課題/領域番号 |
19J20430
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
前野 優香理 東北大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| キーワード | 天然物化学 / 生合成 / ドウモイ酸 |
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| 研究実績の概要 |
DA生産珪藻Pseudo-nitzschia multiseriesが有するDA生合成環化酵素DabCは、基質特異性が低いことが先行研究より予想されていた。そこで、化学合成した多様な開環型基質と、DabCの酵素的環化反応を用いることで、ゲラニル基末端が多様なDA類縁体環化産物が得られると予想した。DabCの発現はすでに前年度に成功しており、今年度は基質の化学合成と、DabC変換効率の上昇に向けた最適化を行い、変換実験を試みた。
はじめに、ゲラニル基末端が異なる4種の基質を化学合成した。メチル型、ヒドロキシメチル型の2種はすでに合成法が確立されており、既報を参考にした。アミド型とメチルエステル型は、既報のカルボキシル型の基質の合成法を一部改変することで合成を達成した。
次に、DabC変換反応条件の最適化を試みた。DabCの真の基質はゲラニル基末端がカルボキシル型であり、疑似基質を用いた場合は変換効率が低いことが予想されたため、合成が最も簡便なメチル型基質を用いて条件検討を行った。本変換反応は、DabCを発現させた大腸菌の培養液に化学合成した基質を添加することで、数日間経過した培地中から環化産物が得られるというシステムである。そのため、大腸菌の培養液に種々の改良を施し、培養条件を最適化することにした。改変した点は (1)培地中のpHが中性になるようにNaOHを添加 (2)培地中のグルコース濃度をモニタリングしながら、グルコースを追加添加 (3)DabCは非ヘム鉄依存性の酵素であることから硫酸鉄 (二価鉄イオン) を添加、の3点である。これにより、環化産物の収率が2倍に上昇した。この改良系を用いて4種の基質を変換反応に供した結果、メチルエステル型以外の3種の環化産物は得られた。今後は得られた環化産物を生理活性試験に供し、DAのゲラニル基末端における構造活性相関の知見を得る予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究で用いたドウモイ酸の生合成環化酵素は、先行研究のデータから、基質特異性が低いことが予想されていた。これを利用し、多様な疑似基質の環化反応を試みる予定であったが、本酵素は予想していたほど基質特異性は低くなく、疑似基質を用いた場合、環化反応の効率は著しく低いことが分かった。そのため、変換反応条件の最適化に多くの時間を費やすことになった。本変換実験は大腸菌の培養液中での変換させるin vivo変換であることから、準備は簡便であるものの、大腸菌の生育状態等で変換効率は変動し、再現性を維持するコツをつかむまで何度も試行を繰り返すことになった。また、微量にしか生成しなかった環化産物の取得は非常に困難であったため、基質の量上げが何度も必要になった。特に、アミド型基質の化学合成のみ、予想していなかった副反応が起こり、収率が下がってしまった。文献を参考にすることによりこれを改善することができたものの、本基質の合成に想定以上の時間がかかった。このような理由により、目標としては環化産物の生理活性試験まで行う予定であったが、今年度は環化産物の取得で終了した。
さらに、今年度は未だドウモイ酸の生合成遺伝子が同定されていない珪藻種Nitzschia navis-varingicaから、ドウモイ酸の生合成環化酵素DabC(NitDabC)を同定することにも挑戦した。探索方法としては、P. multiseriesのDabCと、DabCと相同性の高い紅藻由来のドウモイ酸環化酵素、RadCのアミノ酸配列を比較し、共通のアミノ酸配列に対してそれぞれ縮重プライマーを設計し、N. navis-varingicaのgDNAをテンプレートとしてPCRをかけ、NitDabCの内部配列を探索するというものである。しかし、未だ増幅産物は得られておらず、進展は無かった。このような理由から、「やや遅れている」と考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、これまで得られた三種のドウモイ酸新規類縁体について、生理活性試験を行う。マウスへの脳室内投与試験を行い、活性が高いことが判明した化合物についてはさらに標的受容体であるイオンチャネル型グルタミン酸受容体(iGluR)のサブタイプ選択性を調べる。簡便な評価系は未だ報告が無いため、研究代表者自身で評価系を構築する予定である。具体的には、iGluRが発現していることが報告されているラットの脳に対して、市販のサブタイプ選択的なリガンドと目的のサンプルをふりかけ、競合試験を行う。サンプルがiGluRに結合せず残留した量をLCMSにより定量分析し、結合強度を調べる。評価系の構築と、得られた化合物の構造活性相関をまとめ、論文に投稿する予定である。
また、Nitzschia navis-varingicaのドウモイ酸生合成遺伝子の同定も、並行して遂行する。これまで縮重プライマーを用いたPCRにより、生合成環化酵素の一種、DabCをクローニングすることを目指してきたが、本アプローチでは探索に多くの時間を要し、解決への道は遠いと考えられる。そのため、(株)生物技研にNitzschia navis-varingicaのgDNAを送付し、ゲノム解析を依頼する予定である。これまですでに他種の珪藻で同定されているドウモイ酸生合成遺伝子との配列比較により、Nitzschia navis-varingicaのドウモイ酸生合成遺伝子クラスターを見出す。見つかった酵素遺伝子は、先行研究を参考にベクターに組み込み大腸菌で発現させ、in vitroによる酵素変換実験を行う予定である。酵素反応に用いる基質はこれまでに化学合成を完了してある。予想される変換反応産物の標品もすでに化学合成により得られている。
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