| 研究課題/領域番号 |
19J20619
|
|---|
| 研究機関 | 筑波大学 |
|---|
研究代表者 |
矢野 更紗 筑波大学, 生命環境科学研究科, 特別研究員(DC1)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-25 – 2022-03-31
|
| キーワード | 微小核 / 大脳皮質 / 神経細胞 / ミクログリア / 細胞外分泌因子 / 細胞間コミュニケーション / 自然免疫応答 |
|---|
| 研究実績の概要 |
哺乳類の大脳皮質の発生過程では、神経幹細胞が非対称分裂を繰り返し、分化した神経系前駆細胞は所定の場所へ移動し、軸索や樹状突起が伸長することで神経回路が形成される。この過程において、神経細胞は様々なストレスを受け、損傷を受ける。この過程で生じた異常な神経細胞は、免疫担当細胞であるミクログリアによって除去される。ミクログリアは、損傷した神経細胞から分泌される因子を受容すると標的細胞に遊走し、膜表面に提示されたシグナルを認識し、貪食する。しかしながら、ミクログリアが損傷した神経細胞を感知、除去する機構は十分に理解されていない。本研究課題では、胎児期の脳で、神経細胞が脳室下帯から表皮側へ移動する際に核の先端がくびり取られ、微小核が産生されることを見出した。微小核とは、正常な核とは別に存在する小さな核様構造体であり、ゲノム不安定性の指標として知られているが、中枢神経系での機能について不明な点が多い。そこで、損傷を受けた神経細胞が持つ微小核に着目し、神経細胞とミクログリア間の情報伝播の分子機構を解明することを目的とした。これまでに、オートファジー活性が低下した神経細胞が微小核を細胞外へ放出することを見出した。そして、放出された神経細胞の微小核がミクログリアによって取り込まれることを明らかにした。微小核陽性なミクログリアはアメボイド型であり、貪食脳マーカー遺伝子が強く発現していた。今後は、微小核がミクログリアの貪食能を促進する新規制御因子になりうるか検証し、大脳皮質発生過程のダメージを蓄積した神経細胞をミクログリアが感知・除去する機構に寄与するか解明する。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
① 神経細胞の微小核が細胞外へ放出される分子機構
神経細胞から微小核が分泌されているか調べるため、投射神経細胞特異的に核膜をラベリングしたNexCre; Sun1-sfGFP-Myc(神経特異的Sunタグ)マウスを用いてin vitro、in vivoで検討した。in vitro系では、神経特異的Sunタグ初代培養神経細胞の培地上清から細胞外微小核を抽出する方法を分画遠心法によって確立することができた。そのため、次年度には速やかに網羅的な質量解析ができることが期待できる。また、in vivoの解析により、出生後マウスの脳内において細胞外微小核が多く観察される領域を特定することができた。今までに、神経細胞のオートファジー活性が不全になると微小核が細胞内に蓄積し、放出されることが明らかになっている。今年度にオートファジー活性を定量するプローブは準備したため、次年度に速やかに細胞外微小核が多くみられる領域付近のオートファジー活性を定量することが期待できる。
②神経由来微小核のミクログリアによる取り込み
神経細胞外へ放出された微小核に対してミクログリアがどのような挙動を示すのか検証するため、神経特異的Sunタグマウスの初代培養神経細胞の培地上清をミクログリア細胞株BV2に添加した後に観察した。その結果、BV２細胞内にGFP陽性な微小核様の構造体が存在しており、神経細胞由来の微小核がミクログリアに取り込まれることが明らかになった。
脳発生過程のミクログリアにおける微小核の機能を明らかにするため、出生直後の神経特異的Sunタグマウスの脳切片を貪食活性マーカーであるCD68を免疫染色したところ、神経細胞由来微小核を保持するミクログリアは、CD68を強く発現していた。このことから、神経由来微小核は貪食能が高いミクログリアに取り込まれており、細胞内で分解されていることが示唆された。
|
| 今後の研究の推進方策 |
①神経細胞外の微小核の性状を解析するため、昨年度に確立した細胞外微小核を抽出する方法で得た細胞外微小核画分をRNA-seqやLC/MSで解析する。
②細胞外微小核が多くみられる領域付近のオートファジー活性を定量するため、オートファジーの活性を可視化するためのプローブを子宮内電気穿孔法で導入し、生体内の神経細胞において微小核の蓄積とオートファジー活性の関連性を明らかにする。
③神経由来微小核の取り込みに関与する膜タンパク質の候補を直接的に探索するため、166種からなる低分子化合物ライブラリーを用いることにした。今年度は、ミクログリアの微小核陽性細胞をハイスループットでスクリーニングするための実験条件の検討や画像解析手法の確立した。次年度は、ミクログリアの微小核の形成を抑制する化合物のスクリーニングを行い、ミクログリアの細胞外微小核の取り込みに必要なシグナル伝達経路を同定する。
④ミクログリアにおける微小核の機能の解明するため、自然免疫応答に着目し、ミクログリアにおける神経由来微小核の機能を解明していく。
|
