| 研究課題/領域番号 |
19J22409
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
佐々木(久保山)文音 アヤネ 東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| キーワード | Tmem100 / 骨格筋 / 萎縮 / DNA分解 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、多様な筋萎縮条件下の骨格筋細胞で発現上昇することを見出した膜タンパク質Tmem100について解析を進めている。
【骨格筋Tmem100の発現制御機構の解析】前回までに、合成グルココルチコイドのデキサメタゾンを処理した培養骨格筋細胞C2C12でTmem100の発現が上昇することを見出していた。グルココルチコイドは絶食時に血中濃度が上昇する副腎皮質ホルモンであり、核内受容体のグルココルチコイドレセプターへの結合を介して筋萎縮を誘導する。グルココルチコイドによるTmem100の発現誘導が生体骨格筋でも生じることを確かめるため、デキサメタゾンを投与したマウスの骨格筋を回収し遺伝子発現を測定したが、期待に反してTmem100の発現は顕著な変動を示さなかった。
【筋萎縮時のTmem100の機能解明】マウス骨格筋にTmem100を過剰発現させた過去の実験から、Tmem100がDNA分解促進作用を有することが示唆されてきた。今回は、まずTmem100のDNA結合能の有無を評価するため、ビオチン修飾したTmem100ペプチドまたはネガティブコントロールとしてビオチンをそれぞれEGFP発現プラスミドとともにインキュベートし、ストレプトアビジンビーズによるプルダウンを行った。プルダウンサンプルからDNAを抽出しリアルタイムPCRに供したところ、Tmem100ペプチドにEGFPプラスミドが結合していることが示された。次に、Tmem100によるDNA分解促進作用を経時的に観察するため、マウス骨格筋にTmem100発現プラスミドとルシフェラーゼ発現プラスミドを共発現させ、基質投与時の発光を指標にすることでプラスミドすなわちDNAが分解されるかを検証した。予想通り、Tmem100の過剰発現によって発光がより早く減衰するようになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Tmem100のDNA結合能およびDNA分解促進作用を示すことができたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
【筋萎縮時のTmem100発現調節機構の解析】
昨年度は、筋萎縮時のTmem100の発現上昇に関与すると期待されたグルココルチコイド受容体に関して解析を進めたが、結果的に生体骨格筋ではグルココルチコイド受容体とTmem100発現制御の関連性を見出すことはできなかった。そこで、本年度は筋萎縮との関連が報告されている他の転写因子に幅を広げ、培養骨格筋細胞を用いたプロモーターアッセイ等によって骨格筋Tmem100の発現調節機構を探索したいと考えている。
【骨格筋Tmem100の機能解析】
昨年度の実験結果より、Tmem100がDNA結合能およびDNA分解の促進作用を有することが示唆された。本年度は、in vivoエレクトロポレーション法を用いてマウス骨格筋にTmem100 shRNAとルシフェラーゼ発現プラスミドを共発現させ、基質投与時の発光を指標にすることでプラスミドすなわちDNAの分解が抑制されるかどうかを検証したい。また、筋萎縮モデルマウスにおいてTmem100をノックダウンし、筋萎縮状態からの回復等を評価していく予定である。
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