赤外分光法による新奇特殊ロドプシンの分子機構解析

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19J22788
• 研究機関: 名古屋工業大学
• 研究代表者: 富田 紗穂子 名古屋工業大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
• 研究期間 (年度): 2019-04-25 – 2022-03-31
• キーワード: 微生物型ロドプシン / レチナール / 赤外分光解析

研究実績の概要

本研究では、赤外分光測定を中心とした様々な分析手法を駆使し、これまでに研究されてきた典型的なロドプシンとは本質的に異なる未解明な分子機構を明らかにすることを目的としている。本年度の研究成果の概要を以下に記述する。
KR2とは初めて発見されたナトリウムイオンポンプ型ロドプシンであり、オプトジェネティクスツールとして応用する上でその吸収波長の長波長化が求められている。KR2のナトリウムポンプ機能を保ったまま吸収波長が長波長シフトする変異体について低温赤外分光測定を行い、レチナールの異性化が野生型と同様である一方、レチナールのねじれの度合いを表すHOOPの振動モードも吸収波長と相関関係を示すことを見いたした。上記の内容をNature Communicationsに発表することができた。
また、イオン輸送に重要なアミノ酸変異体の低温赤外分光測定から、KR2の内部で形成されている水分子との強い水素結合は、シッフ塩基ではなく第二カウンターイオンとの間で形成されていることを示唆した。さらに、その第二カウンターイオンと相互作用していると考えられるアルギニンが、KR2のナトリウムポンプ機能を発揮する上で重要な役割を担っていることも示唆された。これらのデータをまとめた論文を執筆し、筆頭著者となる論文をBiochim. Biophys. Acta. Bioenerg.に発表することができた。
さらに、KR2の光反応サイクル中の構造変化についてより詳しく調べるために時間分解赤外分光測定も行っている。
近年のゲノム解析の発展により、新たに発見されたヘリオロドプシンとシゾロドプシンという二種類の微生物型ロドプシンについて、低温赤外分光測定による構造変化解析を行い、ヘリオロドプシンの解析結果はNatureに、シゾロドプシンの解析結果はScience Advances (4/10)にそれぞれ発表された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度までにKR2の吸収波長決定やイオン輸送機能において重要とされているアミノ酸変異体について低温赤外分光測定を行い、得られたスペクトルを野生型と比較することで、KR2について新たな知見が得られ、論文にも発表することができた。KR2だけでなく、新たに発見されてきたヘリオロドプシンやシゾロドプシンについても同様の赤外分光解析を行った。それらのタンパク質の光反応サイクル中の構造変化が、これまでに見つかっている典型的なロドプシンとは全く異なることを明らかにした。これらの内容について、共著の論文として発表するだけでなく、自ら執筆し筆頭著者となる論文も発表することができた。また、ヘリオロドプシンについては野生型だけでなく、同位体標識試料の赤外分光測定も行い、いくつかのバンドの帰属に成功した。
KR2の水和フィルムと乾燥フィルムにおいて変化する水素面外変角振動 (HOOP)バンドを、同位体標識試料を精製して用いることで帰属した。また、水和フィルムと乾燥フィルムの紫外可視吸収スペクトルについてバンドフィッティング解析を行い、波長成分を分離することで水和時と乾燥時の構造変化について考察を深めている。
同時に、時間分解赤外分光測定も積極的に行っており、様々な測定条件での時分割スペクトルのSVD解析やグローバルフィッティング解析を行った。これにより、ナトリウム、リチウム、プロトン輸送時の構造変化の違いを見出した。その中でもレチナール由来のバンドに着目し、レチナールの同位体試料の測定から、水素面外変角振動（HOOP）バンドの帰属に成功した。
また、KR2の表面増強赤外分光測定に向けて、Hisタグの位置をC末端からN末端側に変えた遺伝子を作成し、タンパク質の発現を確認した。
このように研究は期待通り進展しており、今年度も引き続き継続していく。

今後の研究の推進方策

昨年度行ったヘリオロドプシン同位体標識試料の赤外分光解析において、期待したバンドシフトが得られなかったアミノ酸特異的同位体標識試料があった。これら試料について質量分析によって、その同位体標識効率を評価し、バンドシフトが見られなかった原因を調べる予定である。試料の標識効率が低かった場合には、試料調製法の条件検討を行う必要があると考えている。
KR2の水和フィルムと乾燥フィルムにおける構造変化解析について、かなりデータが蓄積されており、詳細な構造変化スキームを考察して論文投稿を目指す。
KR2の時間分解赤外分光測定については、昨年度蓄積した同位体標識レチナール試料のスペクトルより、KR2の光反応サイクル中のレチナールの構造変化スキームの解析を行う。さらに、タンパク質の同位体標識試料の測定も行うことで、光反応サイクル中のタンパク質の構造変化だけでなく、ナトリウム、リチウム、プロトンポンプ時の構造変化の違いをより詳細に明らかにしたいと考えている。場合によってはヘリオロドプシンの時と同様に質量分析による同位体標識効率も調べる。さらに、KR2の構造変化と吸収波長変化の相関関係について理解を深めるため、時間分解赤外分光測定時と同様の水和フィルムでの過渡吸収測定を計画している。
また、ロドプシンの新規計測技術となる表面増強赤外分光測定でのKR2のシグナル検出にも挑戦したいと考えている。そのため、まずは金薄膜の蒸着技術を習得し、すでに論文として発表されているpSRⅡレチナールタンパク質を用いた再現実験から始めたいと考えている。
以上のような計画により、ヘリオロドプシンやKR2について光誘起、または水和誘起の構造変化について新たな知見を得たい。

研究成果

• [雑誌論文] Infrared spectroscopic analysis on structural changes around the protonated Schiff base upon retinal isomerization in light-driven sodium pump KR2 (2020)
  • 著者名/発表者名: Tomida Sahoko、Ito Shota、Mato Tomoya、Furutani Yuji、Inoue Keiichi、Kandori Hideki
  • 雑誌名: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 巻: 148190 ページ: 148190～148190
  • DOI: 10.1016/j.bbabio.2020.148190
  • 査読あり
• [雑誌論文] Schizorhodopsins: A family of rhodopsins from Asgard archaea that function as light-driven inward H+ pumps (2020)
  • 著者名/発表者名: Inoue Keiichi、Tsunoda Satoshi P.、Singh Manish、Tomida Sahoko、Hososhima Shoko、Konno Masae、Nakamura Ryoko、Watanabe Hiroki、Bulzu Paul-Adrian、Banciu Horia L.、Andrei Adrian-Stefan、Uchihashi Takayuki、Ghai Rohit、Beja Oded、Kandori Hideki
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 6 ページ: eaaz2441
  • DOI: 10.1126/sciadv.aaz2441
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Red-shifting mutation of light-driven sodium-pump rhodopsin (2019)
  • 著者名/発表者名: Inoue Keiichi、del Carmen Marin Maria、Tomida Sahoko、Nakamura Ryoko、Nakajima Yuta、Olivucci Massimo、Kandori Hideki
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 10 ページ: 1993
  • DOI: 10.1038/s41467-019-10000-x
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Crystal structure of heliorhodopsin (2019)
  • 著者名/発表者名: Shihoya W.,Inoue K.,Singh M.,Konno M.,Hososhima S.,Yamashita K.,Ikeda K.,Higuchi A.,Izume T.,Okazaki S.,Hashimoto M.,Mizutori R.,Tomida S.,Yamauchi Y.,Abe-Yoshizumi R.,Katayama K.,Tsunoda S. P.,Shibata M.,Furutani Y.,Pushkarev A.,Beja O.,Uchihashi T.,Kandori H.,Nureki O.
  • 雑誌名: Nature 巻: 574 ページ: 132～136
  • DOI: 10.1038/s41586-019-1604-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Time-resolved FTIR spectroscopy for studying molecular mechanisms of sodium and lithium ion transportation of Krokinobacter rhodopsin 2 (2019)
  • 著者名/発表者名: Sahoko Tomida, Hideki Kandori, Yuji Furutani
  • 学会等名: The 57th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • 国際学会