| 研究課題/領域番号 |
19J22988
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
柿元 百合子 山形大学, 大学院医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| キーワード | オルガネラ間コンタクトサイト / ERMES / 小胞体ストレス / Split-GFP / ミトコンドリア / 小胞体 |
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| 研究実績の概要 |
真核細胞にはミトコンドリアや小胞体などの細胞小器官(オルガネラ)が高度に発達しており，細胞の生存に必須の役割を果たしている。最近の研究によりオルガネラ間がタンパク質複合体を介して物理的に結合し機能していることが分かってきた。我々は独自に開発した実験系を用いて，出芽酵母の複数のオルガネラの組み合わせでオルガネラ間近接の検出に成功した。しかし，これらオルガネラ間の結合を担う因子や結合を制御する因子はほとんど解明されていない。また出芽酵母に小胞体ストレス誘導すると，一細胞あたりのERMES複合体の数が劇的に増加することを発見したが，数が増加するメカニズムの詳細は未解明である。本研究は，(1)新規オルガネラ間コンタクトサイトの結合・調節因子の同定と機能評価，(2)細胞ストレス時のERMES数増加メカニズムの解明の2点を目的とした。
昨年度は，始めに独自に開発したSplit-GFPを用いたオルガネラ膜間近接評価実験系を駆使し，蛍光強度を指標に新規オルガネラ間結合（調節）因子のスクリーニングを行った。具体的には，「ミトコンドリア－小胞体」，「小胞体－液胞」膜間にSplit-GFPを発現する酵母株に任意の酵母ゲノムが過剰発現する酵母ゲノムマルチコピーライブラリを導入し，セルソーターにかけることで変異 (プラスミド) 導入前と比較してGFP蛍光シグナルが変化する細胞集団の単離に成功した。続いて，超解像蛍光顕微鏡を用いたライブセルイメージングによって小胞体ストレス時にERMES複合体クラスター構造が解離する様子を観察した。さらに小胞体ストレスの緩和に繋がる小胞体体積の拡大にERMES複合体の数の増加が関与していることが分かった。これまでの結果から，小胞体ストレス時のERMES複合体の数の増加は，一般的な小胞体ストレス応答(UPR経路)に依存しない新しいストレス応答であると考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題の目的である，オルガネラ間の結合を調節する因子の探索を，酵母遺伝学，生化学的な手法で着実に進めている。Split-GFPプローブを用いてオルガネラ間コンタクトを定量化可能にした出芽酵母細胞に酵母過剰発現ゲノムライブラリを導入し，セルソーターによってシグナルが増減する細胞集団を選別，濃縮に成功している。今後，オルガネラ間結合調節因子の同定など研究進展が期待される。
また，小胞体ストレスによってミトコンドリア-小胞体間を直接結合するタンパク質複合体，ERMES複合体のクラスター数が顕著に増加することを発見し，超解像顕微鏡用いたハイスピードライブセルイメージングにより，ERMES複合体のクラスター構造が解離することを世界で初めて見出している。これまでにERMES複合体のクラスター構造が解離する分子機構の解明を目指し，研究を進めている。さらに，小胞体ストレス時にリン脂質組成が変化することを見出したので，その変化がERMESクラスターの数の変化の原因ではないかと仮説を立てて，研究を進めている。また，小胞体ストレスの緩和に重要な小胞体体積の拡大に，ERMES複合体のクラスター数の増加が寄与することが分かってきた。これらの発見は，ERMES複合体が，既存の小胞体ストレス応答に依存しない，新しい小胞体ストレス応答を担っている可能性を示唆しており，インパクトの大きな研究成果となることが期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では，前述した目的(1)を達成するために，Split-GFPを用いたオルガネラ膜間近接評価実験系を駆使したスクリーニングによってGFP蛍光シグナルが変化する細胞集団の単離に成功している。よって本年度は，細胞群に組み込まれたゲノムライブラリーを単離して，次世代シーケンスによって過剰発現した遺伝子を同定する。さらに同定した因子が欠損または過剰発現した酵母株を作製し，オルガネラ間近接パターンが変化するのか，オルガネラ膜構造が変化するのか，既に報告されているコンタクトサイトの機能に関与しているのかなどを検討する。
また目的(2)を達成するためにERMES複合体の数が小胞体ストレス時に増加するメカニズムを，ERMES複合体との相互作用因子の変化に着目して解析を行う。さらに細胞ストレス時にオルガネラ間コンタクトサイトの挙動が変化するのか検証する。具体的には，小胞体ストレス，飢餓ストレスや酸化ストレス時に「ミトコンドリア－小胞体」，「小胞体－液胞」，「ミトコンドリア－液胞」膜間にSplit-GFPを発現する酵母株のGFP蛍光強度や蛍光シグナルパターンが変化するのか検証する。細胞ストレス時にGFP蛍光に変化があったオルガネラ膜の組み合わせについて，オルガネラ間コンタクトが変化する分子機構の解明に取り組む。
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