| 研究課題/領域番号 |
19J23094
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
西村 正宏 東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| キーワード | クロマチン / ヌクレオソーム / p53 / ヒストン / パイオニア転写因子 |
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| 研究実績の概要 |
がん抑制遺伝子の発現を促進する転写因子であるp53は、通常の転写因子が結合できないとされているヌクレオソーム形成領域中の標的DNA配列と結合することが知られている(パイオニア転写因子)。本研究ではp53がパイオニア転写因子として働くメカニズムを明らかにするため、p53とヌクレオソームとの相互作用様式を解明する生化学的・構造生物学的解析をおこなっている。
昨年度までの生化学的解析から、p53のN末端側アミノ酸領域がヌクレオソームの構成因子であるヒストンH3-H4複合体と直接結合することがわかっていた。本年度はこの知見に基づいて、新たにN末端側のアミノ酸領域を欠損させたヒトp53変異体を精製し、ヌクレオソームとの結合試験をおこなった。その結果、N末領域を欠失したp53変異体では、野生型と比べて複合体の形成効率が弱まることを見出した。本年度におこなった生化学的解析の成果は、昨年度までに得られた結果と合わせて論文にまとめ、The Journal of Biochemistry誌に発表した。またクライオ電子顕微鏡によるp53-ヌクレオソーム複合体の単粒子解析をおこなうために、標的DNA配列をもつヌクレオソームを大量調製した。さらに、構造解析に最適化したp53変異体も作製し、標的DNA配列をもつヌクレオソームとの複合体を、ショ糖と架橋剤の密度勾配超遠心分離法(GraFix法)により精製した。得られた試料に対して、架橋剤の種類や複合体の濃度、緩衝液の組成、観察用グリッドの氷の厚さなどを検討することで、クライオ電子顕微鏡観察に最適な条件を探索した。得られた観察用グリッドについて透過電子顕微鏡によってデータの収集をおこない、約9000枚の画像を取得した。これらの画像から約200万個の粒子画像を抽出し単粒子解析をおこなうことで、複合体の密度マップを低分解能で得ることに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本年度の計画は、標的DNA配列を含むヌクレオソームとp53からなる複合体の立体構造解析であった。昨年度よりクライオ電子顕微鏡でp53-ヌクレオソーム複合体を観察できる系を探索していたが、本年度はこの系を最適化することで、p53変異体と標的DNA配列を含むヌクレオソームからなる複合体の立体構造を低分解能ながら解析することに成功した。本解析により、p53がパイオニア転写因子としてヌクレオソーム中の標的DNA配列を認識する機構の理解が大きく進展した。今後は、複合体中でp53がヌクレオソーム中のDNAと接している領域を、ヒドロキシラジカルフットプリント法などの手法によって特定することを計画しており、現在はそのために用いる蛍光標識したヌクレオソームの調製をおこなっている。また、複合体中のp53とヒストンとの相互作用領域を網羅的に解析するために、クロスリンク質量分析をおこなうことも予定しており、現在までに架橋したp53-ヌクレオソーム複合体の調製を完了している。また生化学的解析により、p53のN末端側のアミノ酸領域を欠損させた変異体ではヌクレオソームとの複合体形成効率が弱まることを新たに見出した。これらの成果はp53によるヌクレオソーム認識機構の一端を明らかにする重要な知見であったため、これらの研究成果は、日本分子生物学会にて発表し、The Journal of Biochemistry誌に学術論文として報告した。以上の進捗状況を鑑みて、当初の計画以上に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和三年度は、より詳細なp53-ヌクレオソーム複合体の立体構造情報を得るために、引き続き構造生物学的解析をおこなう。昨年度までの研究では、クライオ電子顕微鏡単粒子解析により、p53標的DNA配列を含むヌクレオソームにp53が結合した複合体の低分解能構造を得ることに成功している。今後は高分解能の構造情報を得るために、これまでに得られた知見に基づきp53コンストラクトの改変や構造解析法のさらなる最適化をおこなう予定である。こうした構造生物学的解析と並行してヒドロキシラジカルフットプリント法およびクロスリンク質量分析などをおこなうことによって、p53-ヌクレオソーム複合体内において、p53が接しているヌクレオソーム中のDNA領域やヒストンのアミノ酸残基などの情報を得る。また現在得られている構造情報をもとにして、ヌクレオソーム中のDNAと接していると考えられるアミノ酸残基に変異を導入した新たなp53変異体を作製する。このようなp53変異体を用いて生化学的な解析をおこなうことにより、p53-ヌクレオソーム複合体内におけるp53-DNA相互作用の詳細をアミノ酸残基レベルで明らかにすることで立体構造情報を補完する。以上の研究を通じて、パイオニア転写因子p53によるヌクレオソーム中の標的DNA配列認識機構の詳細を解明していきたいと考えている。最終年度である令和三年度は、上記の研究成果について、学会や論文において発表する。
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