研究課題/領域番号 |
19J40075
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研究機関 | 岩手大学 |
研究代表者 |
宮崎 珠子 岩手大学, 農学部, 特別研究員(RPD)
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研究期間 (年度) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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キーワード | 黄体形成ホルモン / 尿 / 牛 / 猫 / 繁殖技術 |
研究実績の概要 |
本研究は、乳牛の繁殖技術向上を念頭に、排卵前に黄体形成ホルモン(LH)が血中で一過性に上昇した後、尿にLHが排泄されるか、またマウスや猫でも同様の検証を行い、動物におけるLH動態と排泄機構の解明を目指す。排卵の引き金になる血中LHサージは哺乳動物に普遍的におきる生理現象であり、LHサージが起きる分子機構は解明されている。しかし一過性に増加した血中LHがどのように代謝され尿に排泄されるか、尿中LH測定による排卵検査薬が市販され実用化されているヒトでも明らかになってない。そこで本研究は5つの課題を掲げた。課題1.血中LHサージ後、どのくらいの血中LHが尿に排泄されるか明らかにする。課題2.LHが腎臓の尿細管で再吸収されるのか、再吸収を免れるのか明らかにする。課題3.乳牛を用いて血中LHサージの何時間後に尿中LH排泄量が増えるか明らかにする。課題4.乳牛で血中LHサージ後、乳汁にもLHが排泄されるか明らかにする。課題5.無発情牛においても尿中LH測定が人工授精適期の判定に有効か検証する。 一年目は、課題1と課題3に取り組んだ。課題1では、ホルモン処置により健康な雌猫を発情させ、採尿した後、雄猫と交尾させ血中LHサージを誘発した。交尾前、交尾後2、4、6、8時間に血液と尿を採取し、これを2日間繰り返した。現在3頭分の血液および尿サンプルがあるので、更に検体数を増やし解析する。また課題3では、和牛2頭をホルモン処置により発情同期化し、LHサージを起こす性腺刺激ホルモン放出ホルモンを投与し、投与前、投与後1、2、3、4時間に血液と尿を採材し、LHを測定した。その結果、血中LHが尿中に排泄され尿中LH濃度が経時的に変化することが明らかになった。今後は頭数を増やし、採材時間も延長して、正確な血中および尿中LH動態を明らかにしていきたい。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の主目的である牛黄体形成ホルモン(LH)が、発情期の尿中で検出されるか生化学的なアプローチで取り組んだ。尿中LHは血中LHに比較して非常に低濃度であったため検出するまでに時間を要したが、新たにプロテオミクスの手法を学び、SDS電気泳動で尿タンパク質を分離した後、黄体形成ホルモンの推定分子量に位置するバンドを切り出し、トリプシン消化後に質量分析計で構造解析した。結果的に尿中タンパク質のプロテオミクスで牛の黄体形成ホルモンを検出することはできなかったが、研究手法を変えて、ELISAによりホルモン処置で発情誘起した牛の尿から黄体形成ホルモンを検出することに成功した。当初の仮説通りの結果を得ることができたので、研究計画に基づいて研究を進めていくための土台を作ることができた。また研究を発展させるための生化学的手技も修得することができた。
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今後の研究の推進方策 |
今後は、課題1と3の検体の追加および解析を行い、早い時期に結果を論文としてまとめることを目指す。 また課題2のLHが腎臓の尿細管で再吸収されるのか、再吸収を免れるのか明らかにすることを目的に、マウスを用いて、腎臓の近位尿細管でのLHの再吸収についても検証を進める。腎臓の近位尿細管は、タンパク質の再吸収機構が発達している。この再吸収機構に分子量600万のメガリンという膜タンパク質が関与している。メガリンは近位尿細管上皮細胞膜の管腔側に高発現しており、腎臓の糸球体を通過した血清タンパク質を結合し、エンドサイトーシスで細胞内に再吸収する。よって糸球体を通過したLHが尿に排泄されるためには、メガリンによる再吸収を免れるか、メガリンに再吸収される以上のLHが糸球体を通過してくる必要ある。そこで腎臓におけるLH動態を明らかにするため、メガリンにLH結合能があるか、尿細管でLHが再吸収されるか検証する。 さらに課題4の乳牛で血中LHサージ後、乳汁にもLHが排泄されるか明らかにすることを目的に、採材計画を立て実行していきたい。
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