| 研究課題/領域番号 |
19J40136
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
小田(石井) いずみ 京都大学, 理学研究科, 特別研究員(RPD)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| キーワード | 転写因子 / Zic / 結合モチーフ / 転写調節 / ホヤ |
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| 研究実績の概要 |
転写因子による特定のDNA塩基配列（結合モチーフ）への特異的な結合は、細胞がゲノム情報を読み解く最初のステップであり、多くの生物学的プロセスの基盤である。これまで一つの転写因子は結合するDNAモチーフを一つもつと考えられてきたが、近年、多くの転写因子が従来決定された結合モチーフ（primaryモチーフ）とは大きく異なるsecondaryモチーフにも高い親和性で結合することがわかってきた。しかし、生体内におけるこれらの使い分けについてはよくわかっていない。
申請者はこれまでに、ホヤのZic転写因子Zic-r.aが、primaryモチーフとsecondaryモチーフを、細胞の種類に応じて使い分けて転写調節を行っていることを示唆する結果を得ており、これをさらに検証し、多くの転写因子がもつ２つの結合モチーフのはたらきおよび生物学的意義を明らかにすることを本研究の目的としている。
これまでに申請者は、Zic-r.aが母性に発現する筋肉系譜細胞で、標的遺伝子の転写をシス調節領域内のsecondaryモチーフへの結合を介して調節していることを明らかにした。これに対し、シス調節領域内のprimaryモチーフを介して転写調節されている標的遺伝子は、Zic-r.aが胚性に発現する神経系細胞で発現する遺伝子の中にみつかるのではと考え、実験的に作成した神経マーカーのみを強く発現する胚でZic-r.aの機能を阻害し、トランスクリプトーム解析をすることにより、神経系細胞でのZic-r.aの標的遺伝子を同定した。これらの標的遺伝子のシス調節領域にはZic-r.aが結合するprimaryモチーフがみつかっており、今後解析することにより、２種類の結合モチーフの使い分けについて明らかにすることができると考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Zic-r.aのsecondaryモチーフへの結合を介した標的遺伝子の転写調節機構については、母性Zic-r.aが転写調節を行う筋肉系譜細胞で発現するTbx6-r.bについて、詳細な解析を行うことができたが、secondaryとprimary、２種類の結合モチーフの間で比較を行うために、primaryモチーフを介して調節される標的遺伝子をみつける必要があった。そのような標的遺伝子は、胚性Zic-r.aが発現する幼生の神経系細胞で発現している可能性が考えられたが、ホヤ幼生の神経系細胞は細胞数が多い組織ではないため、Zic-r.a機能阻害胚のトランスクリプトーム解析では、バックグラウンドが高くなり、効率的に標的遺伝子を同定できない可能性が高かった。そこで申請者は、実験操作により神経系マーカーのみを強く発現し、他の組織マーカーはほぼ発現しない胚を作成し、この実験胚からZic-r.a機能阻害胚を作成してトランスクリプトーム解析を行うことで、神経系細胞で発現し、Zic-r.a機能阻害により発現レベルが低下する、Zic-r.a標的遺伝子を同定することに成功した。これらの標的遺伝子のシス調節領域にはprimaryモチーフがみつかっており、ゲルシフトアッセイにより、Zic-r.aが結合することが確認できた。このようにprimaryモチーフを介してZic-r.aに調節されている標的遺伝子の有力な候補をみつけることができたことから、次年度以降の解析をスムーズに進めることができるため、研究はおおむね順調に進行していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請した研究計画では、採用２年目はprimaryモチーフまたはsecondaryモチーフのどのような特長が、異なる種類の細胞で異なる標的遺伝子の転写の活性化を可能にしているのかを明らかにするために、２つのZic結合モチーフそれぞれのコンセンサス配列と一定の一致率を示す塩基配列を網羅的に含むZic結合モチーフライブラリーを作成し、各種のprimaryまたはsecondaryモチーフがホヤ胚のどの細胞で転写を活性化するか解析することを予定していた。しかし、採用１年目に神経系細胞で発現するZic-r.a標的遺伝子およびそのシス調節領域のprimaryモチーフを複数同定できた事から、採用２年目はこれらの実際に胚発生過程で使われていると予想される結合モチーフについての解析を優先する予定である。特にprimaryおよびsecondaryモチーフは胚発生過程でどのように使い分けられているかをシスレポーター解析、ゲルシフト解析、ChIP解析などにより調べる。また、それらの使い分けとZic-r.aの各結合モチーフへの結合親和性および各細胞内のZic-r.aタンパク質量との関係を解析する。その結果をふまえ、採用３年目には解析をホヤのもう一つのZic転写因子、Zic-r.bにも広げ、同じファミリーの２つの転写因子がどのようにして同じまたは異なる遺伝子を標的としているのかについても解析する予定である。
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