| 研究実績の概要 |
これまでに、赤色蛍光タンパク質であるmCherryに、EMARS反応触媒酵素であるAPEX（アスコルビン酸ペルオキシダーゼ）とガレクチン３を連結させ、さらに、HiBiT Tagを付加した”mCherry-APEX-ガレクチン３-HiBiT発現ベクター”を作製している。本ベクターをHeLa細胞に導入し、安定発現株を作製した（HeLa WT）。また、ガレクチン３の糖鎖認識部位に変異（R186S）を導入したガレクチン３糖鎖認識変異株も同時に作製した(HeLa R186S)。作製した細胞株において、ガレクチン３の分泌量を培養液中のHiBiTとその基質による発光にて測定したところ、HeLa R186S株の分泌量はHeLa WTに比べておよそ1/10の分泌量であった。また、コレステロール合成・輸送阻害剤であるU18666Aを添加すると、ガレクチン３の分泌量が、およそ２倍増加することが明らかとなった。
続いて、上記の細胞株および分泌条件を用いてEMARS反応を行い、SILAC法にて質量分析を行った。まず、細胞をLight(EMARSなし), Heavy(EMARSあり)の条件にて標識し、10日間培養した。標識した細胞にEMARS反応を行い、タンパク質量が1:1になるように混合し、LC－MS/MS質量分析を用いて解析した。その結果、Light<Heavyとなるタンパク質が204個同定された。この中には、Galectin 3およびmCherry-APEX-ガレクチン３も同定されていた。また、Log2 (ratio L/H)<-1のタンパク質として60S ribosomal protein, Heat shock protein HSP 90など13個が同定され、これらはガレクチン３分泌に関わる候補分子と考えられた。
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