樹状細胞の抗原識別能力を利用した抗アレルギー効果を有する酒粕由来有用菌の同定

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K02336
• 研究機関: 高崎健康福祉大学
• 研究代表者: 今井 純 高崎健康福祉大学, 薬学部, 准教授 (30342918)
• 研究分担者: 坂井 隆浩 高崎健康福祉大学, 薬学部, 助教 (10418618)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 樹状細胞 / 腸内細菌叢 / Th状態 / 抗アレルギー効果 / 有用菌 / ユビキチン / 自然免疫 / スクリーニング

研究実績の概要

本研究の目的は酒粕などの各種食発酵食品から、樹状細胞の抗原識別能力を利用し、抗アレルギー効果を持つ有用菌種を同定することである。令和2年度には、蛍光ユビキチン間のFRETを指標として、Th1誘導能力を認めた食品から株化した乳酸菌のユビキチン鎖蓄積能力、Th1誘導能力を検証した。これらの乳酸菌を樹状細胞に添加すると、細胞内のユビキチン鎖が蓄積するとともに、IFN-β、IL-12などのTh1サイトカインを誘導する。しかし、ユビキチン鎖蓄積能力、Th1サイトカイン誘導能力は、同定した発酵食品とそこから株化した菌、及び株化した菌の間で顕著な差異が存在する。現在、これらの差異の原因を解析するとともに、株化した菌のゲノム解析による同定、株化した菌の抗アレルギー効果をマウスの個体レベルで検証を行なっている。
これまでの研究結果は、樹状細胞内の抗原の輸送経路については、「Imai J, Ohashi S, Sakai T. Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation-Dependent Processing in Cross-Presentation and Its Potential for Dendritic Cell Vaccinations. Pharmaceutics. (2020), 13, 12, pii: E153.」として、この光学的定量法を活用した抗アレルギー有用菌の同定方法は「Imai J, Koganezawa Y, Sakai T. Dendritic cells as a detecting unit for beneficial anti-allergy microbes. The Allergy in Practice. (2020), 40(6) 13-17.」として発表した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

1.Th1誘導能力を認めた食品、その食品から株化した乳酸菌を含む培養液、及び株化した乳酸菌を精製した菌体の間で、ユビキチン鎖蓄積能力、Th1サイトカイン（IFN-β、IL-12）誘導能力に顕著な差異が存在する場合がある。このため、ゲノム解析を行なって菌種を同定し、個体レベルでの抗アレルギー効果の解析に移行する菌株を決定する過程に遅れが生じている。これに対する対策は今後の推進方策（1）に示す。
2.樹状細胞は非自己の感染や異常な細胞死を検出する多様なセンサー分子を発現し、生体の様々な異常を高い感度で検出する。本研究はこの樹状細胞の抗原検出能力を応用して、有用菌のスクリーニングを行なっているが、樹状細胞は細胞の損傷などによって放出されるダメージ関連分子を検出し、ユビキチン鎖を蓄積、Th1サイトカインを分泌する。また同様な現象は細胞密度の上昇によっても発生し、Th1誘導能力検証時のバックグランドを著しく亢進させる。この現象に対する対策は今後の推進方策（2）に示す。
3.Th1誘導能力の確認に使用している樹状細胞の培養細胞（DC2.4、mutuDC）の間で、Th1誘導刺激に対するユビキチン鎖の蓄積量、Th1サイトカイン（IFN-β、IL-12）の発現量が異なる。この結果も、爾後の解析を実施する菌株を決定する過程に遅れを生じる原因となっている。これに対する対策は今後の推進方策（3）に示す。
4.個体レベルでの解析の進行が遅延している。これに対する対策は今後の推進方策（4）に示す。

今後の研究の推進方策

1.Th1誘導能力を検証している菌体の状態（食品中、培養液中、精製菌体）によるユビキチン鎖蓄積能力、Th1サイトカイン（IFN-β、IL-12）誘導能力の差異には、量的な差異（サイトカインの誘導量）と質的（サイトカインの有無）な差異の双方が共存する。量的な差異については、菌体量の変動によるTh1誘導能力の変化に基づいて検証する。質的な差異については、菌体を滅菌フィルターで除去したサンプルを使用し、代謝産物など菌体以外の成分が影響している可能性について検証する。また経時的な解析を行なって、ユビキチン鎖蓄積能力、Th1サイトカイン誘導能力の間の時系列による違いを明確化する。
2.植え継ぎに伴う細胞の損傷と、この時に放出されるダメージ関連分子による樹状細胞のセンサー分子の活性化を回避することは不可能である。またこのようなダメージ関連分子は細胞密度の増加に伴う細胞の損傷や、樹状細胞が分泌するエクソソームによっても誘導される。このため、1、植え継ぐ細胞数を極力少数に抑制し、2、Th1誘導能力検証時の細胞数を抑制することでその影響を極小化する。
3.樹状細胞の培養細胞（DC2.4、mutuDC）の間では、自然免疫のセンサー分子の発現パターンが異なるため、2種類の培養細胞の間でユビキチン鎖蓄積、サイトカイン発現パターンが完全には一致することは期待できない。しかし、Th1誘導の方向性は概ね一致することが望ましい、方策1、2を実施し、バックグランドレベルのTh1誘導能力を排除した上で精密に検証する。
4.速やかに方策（1〜3）を実施し、個体レベルの解析に移行する菌株を決定し、ゲノム解析に基づいてその菌種を同定し、個体レベルでの解析を実施する。

次年度使用額が生じた理由

株化した菌のゲノム解析とマウスを用いた個体レベルの検証必要とされる経費を確保するため。

研究成果

• [雑誌論文] Detection of beneficial anti-allergy microbes by dendritic cells. (2020)
  • 著者名/発表者名: Imai J, Koike E, Sakai T
  • 雑誌名: The Allergy in Practice 巻: 40 ページ: 829-834
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dendritic cells as a detecting unit for beneficial anti-allergy microbes. (2020)
  • 著者名/発表者名: Imai J, Koganezawa Y, Sakai T
  • 雑誌名: The Allergy in Practice 巻: 40 ページ: 13-17
  • 査読あり