1細胞メタボローム・プロテオーム分析によるがん細胞株の分子フェノタイプ解析

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K05167
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 和泉 自泰 九州大学, 生体防御医学研究所, 准教授 (70622166)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 1細胞メタボローム解析 / 1細胞プロテオーム解析 / シングルセル / がん細胞

研究実績の概要

一般的な動物1細胞からのメタボロームおよびプロテオーム解析を可能にするために，(1) 顕微鏡下で標的とする細胞を迅速に単離する技術，(2) サンプルロスを低減させるための微小空間内での前処理技術，(3) ナノフロー液体クロマトグラフィータンデム質量分析 (Nano-LC/MS/MS) による高感度分析，(4) 微量試料を分析系に導入する技術の開発を行ってきた．今年度は，開発した1細胞メタボローム分析法を用いて，HeLa細胞の不均一性を評価した．22個の単一HeLa細胞のメタボローム分析を実施したところ，18種の親水性代謝物の検出に成功した．さらに，得られた代謝物ピークエリアを用いて階層的クラスター分析を行った結果，細胞の間に，代謝レベルで一定の類似度を示すサブクラスが複数存在することを示した (Mass Spectrom., 9(1): A0080-A0080, 2020)．
さらに，1細胞ショットガンプロテオーム分析を行うために，プロテオミクス分野と連携して試料調製中の損失が低く，消化効率の高い前処理法 (in-line sample preparation for efficient cellular proteomics, ISPEC) を開発した．開発したISPEC法は，より少数の細胞 (100, 10, 1細胞) の適応が可能であり，単一HeLaから60個のタンパク質の同定に成功した(Anal. Chem., 92(4): 2997-3005, 2020)．
また，超高感度分析が期待できる多孔質シリカ層を有する内径50μm以下のモノリスシリカキャピラリーカラムの調製法を構築し，その性能評価を行った(J. Chromatogr. A, 1616: 460804, 2020)．

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

今年度は，HeLa細胞を用いて1細胞メタボローム解析および1細胞プロテオーム解析を実施し，実際に一般的な動物1細胞から代謝物およびタンパク質が検出できることを示した．さらに，HeLa細胞集団から取り出した22個の単一HeLaを分析して得られた代謝物ピークエリアを用いて階層的クラスター分析 (HCA: hierarchical cluster analysis) を行った結果，細胞の間に，代謝レベルで一定の類似度を示すサブクラスが存在することを示した．今回の培養細胞を用いた1細胞メタボローム結果により観測されたサブクラスは，例えば細胞周期の違いあるいはその他の代謝機能の違いを捉えている可能性が示唆された．これらの成果は，Mass Spectrom., 9(1): A0080-A0080, 2020およびAnal. Chem., 92(4): 2997-3005, 2020に受理され，高い評価を得た．また，受理された学術論文の内容の一部は，日本語総説にまとめて報告した．以上のことから，今年度は，当初の計画以上に研究が進展しているといえる．

今後の研究の推進方策

今後は，モノリスシリカキャピラリーカラムなどを活用した分析系のさらなる高感度化と微量サンプル調製法の高速化・自動化技術を開発する．さらに，全ての要素技術を組み合わせることで1細胞レベルでの代謝機能を網羅的かつ定量的に数値化するための基盤技術を構築し，がん細胞の細胞周期と代謝の差異を明らかにする．

次年度使用額が生じた理由

今年度，予想以上に研究が進捗したため，今年度の途中の段階で，来年度に13C標識化合物を使用した予備検討を開始する計画を立てた．一方で，これらの安定同位体化合物の見積もりを取得したところ，当初の予定金額よりも35万円ほど高価であった．そのため，来年度に購入する安定同位体標識化合物の費用に充てるために，今年度の予算の繰り越しが発生した．

研究成果

• [国際共同研究] Vrije Universiteit Brussel(ベルギー)
  • 国名: ベルギー
  • 外国機関名: Vrije Universiteit Brussel
• [雑誌論文] Performance of small-domain monolithic silica columns in nano-liquid chromatography and comparison with commercial packed bed columns with 2 μm particles. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hara T, Izumi Y, Hata K, Baron G V, Bamba T, Desmet G*
  • 雑誌名: J. Chromatogr. A 巻: 1616 ページ: 460804
  • DOI: 10.1016/j.chroma.2019.460804.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Metabolic effects of RUBCN/Rubicon deficiency in kidney proximal tubular epithelial cells. (2020)
  • 著者名/発表者名: Matsuda J, Takahashi A, Takabatake Y*, Sakai S, Minami S, Yamamoto T, Fujimura R, Namba-Hamano T, Yonishi H, Nakamura J, Kimura T, Kaimori J, Matsui I, Takahashi M, Nakao M, Izumi Y, Bamba T, Matsusaka T, Niimura F, Yanagita M, Yoshimori T, Isaka Y.
  • 雑誌名: Autophagy 巻: 16 ページ: 1-16
  • DOI: 10.1080/15548627.2020.1712107.
  • 査読あり
• [雑誌論文] An analytical system for single-cell metabolomics of typical mammalian cells based on highly sensitive nano-liquid chromatography tandem mass spectrometry. (2020)
  • 著者名/発表者名: Nakatani K, Izumi Y*, Hata K, Bamba T.
  • 雑誌名: Mass Spectrom. 巻: 9(1) ページ: A0080
  • DOI: 10.5702/massspectrometry.A0080
  • 査読あり
• [雑誌論文] In-line sample processing system with an immobilized trypsin-packed fused-silica capillary tube for proteomic analysis of a small number of mammalian cells. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hata K, Izumi Y*, Hara T, Matsumoto M*, Bamba T.
  • 雑誌名: Anal. Chem. 巻: 92(4) ページ: 2997-3005
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.9b03993
  • 査読あり
• [雑誌論文] Lipid profiling of serum and lipoprotein fractions in response to pitavastatin using an animal model of familial hypercholesterolemia. (2020)
  • 著者名/発表者名: Takeda H, Izumi Y*, Tamura S, Koike T, Koike Y, Shiomi M, Bamba T.
  • 雑誌名: J. Proteome Res. 巻: 19(3) ページ: 1100-1108
  • DOI: 10.1021/acs.jproteome.9b00602.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A shift in glutamine nitrogen metabolism contributes to malignant progression of cancer. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kodama M, Oshikawa K, Shimizu H, Yoshioka S, Takahashi M, Izumi Y, Bamba T, Tateishi C, Tomonaga T, Matsumoto M*, Nakayama KI*.
  • 雑誌名: Nat. Commun. 巻: 11 ページ: 1320
  • DOI: 10.1038/s41467-020-15136-9
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Lipidomic analysis of cells and extracellular vesicles from high- and low-metastatic triple-negative breast cancer. (2020)
  • 著者名/発表者名: Nishida-Aoki N, Izumi Y*, Takeda H, Takahashi M, Ochiya T*, Bamba T.
  • 雑誌名: Metabolites 巻: 10(2) ページ: 67
  • DOI: 10.3390/metabo10020067.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of acrylamide adducts generated during storage of canned milk coffee. (2020)
  • 著者名/発表者名: Yoshioka T, Izumi Y*, Takahashi M, Suzuki K, Miyamoto Y, Nagatomi Y, Bamba T*
  • 雑誌名: J. Agric. Food Chem. 巻: 68 ページ: 3859-3867
  • DOI: 10.1021/acs.jafc.9b08139.
  • 査読あり
• [雑誌論文] ナノ液体クロマトグラフィー質量分析を基盤としたシングルセル分子フェノタイプ解析． (2020)
  • 著者名/発表者名: 1.和泉自泰*，中谷航太，秦康祐，原健士，松本雅記，馬場健史．
  • 雑誌名: J. Mass. Spectrom. Soc. Jpn. 巻: 68(2) ページ: 44-48
  • DOI: 10.5702/massspec.S20-09
  • 査読あり
• [雑誌論文] A highly sensitive determination method for acrylamide in beverages, grains, and confectioneries by supercritical fluid chromatography tandem mass spectrometry. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshioka T, Izumi Y, Nagatomi Y, Miyamoto Y, Suzuki K, Bamba T*.
  • 雑誌名: Food Chem. 巻: 294 ページ: 486-492
  • DOI: 10.1016/j.foodchem.2019.05.033
  • 査読あり
• [雑誌論文] Improved quantitation of lipid classes using supercritical fluid chromatography with charged aerosol detector. (2019)
  • 著者名/発表者名: Takeda H, Takahashi M, Hara T, Izumi Y, Bamba T*
  • 雑誌名: J. Lipid Res. 巻: 60(8) ページ: 1465-1474
  • DOI: 10.1194/jlr.D094516.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Comparison of retention behavior between supercritical fluid chromatography and normal-phase high performance liquid chromatography with various stationary phases. (2019)
  • 著者名/発表者名: Hirose T*, Keck D, Izumi Y, Bamba T.
  • 雑誌名: Molecules 巻: 24(13) ページ: 2425
  • DOI: org/10.3390/molecules24132425
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A pilot study: Effects of Kombu intake on lifestyle-related diseases, Possibility that an intake of Kombu is effective for the subjects with abnormally high serum triglyceride levels. (2019)
  • 著者名/発表者名: Nishiumi S*, Izumi Y, Kobayashi T, Yoshida M*
  • 雑誌名: Food Sci. Technol. Res. 巻: 25(6) ページ: 827-834
  • DOI: org/10.3136/fstr.25.827
  • 査読あり
• [雑誌論文] Inter-laboratory comparison of metabolite measurements for metabolomics data integration. (2019)
  • 著者名/発表者名: Izumi Y, Matsuda F*, Hirayama A, Ikeda K, Kita Y, Horie K, Saigusa D, Saito K, Sawada Y, Nakanishi H, Okahashi N, Takahashi M, Nakao M, Hata K, Hoshi Y, Morihara M, Tanabe K, Bamba T*, Oda Y.
  • 雑誌名: Metabolites 巻: 9(11) ページ: 257
  • DOI: 10.3390/metabo9110257
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Single-run comprehensive hydrophilic metabolome analysis by unified hydrophilic-interaction/anion-exchange liquid chromatography mass spectrometry (2020)
  • 著者名/発表者名: Kohta Nakatani1, Yoshihiro Izumi1, Masatomo Takahashi1, Keita Sakurai, Michio Butsugan, Takeshi Bamba1
  • 学会等名: AOMSC 2020
  • 国際学会
• [学会発表] Inter-laboratory comparison of metabolite measurements for metabolomics data integration (2020)
  • 著者名/発表者名: Yoshihiro Izumi
  • 学会等名: The 29th Hot Spring Harbor International Symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 親水性相互作用/陰イオン交換クロマトグラフィータンデム質量分析による次世代メタボローム分析法の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 中谷 航太1，○和泉 自泰1，高橋 政友1，櫻井 恵太2，佛願 道男2，馬場 健史1
  • 学会等名: 第67回 質量分析総合討論会
• [学会発表] A Novel Mass Spectrometry-Based Analytical System for Single-Cell Proteomics and Metabolomics in Mammalian Cells (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshihiro Izumi1, Kousuke Hata1, Kohta Nakatani1, Takeshi Hara1, Shohei Yamamura2, Masaki Matsumoto1, Takeshi Bamba1
  • 学会等名: 67th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics
  • 国際学会
• [学会発表] Large-Scale Metabolomic Analysis of Hydrophilic Metabolites Using Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry with a Novel Polymer-Based Amino Column (2019)
  • 著者名/発表者名: Kohta Nakatani1, Yoshihiro Izumi1, Masatomo Takahashi1, Keita Sakurai2, Michio Butsugan2, Takeshi Bamba1
  • 学会等名: 67th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics
  • 国際学会
• [学会発表] Novel analytical method for global metabolomic analysis by hydrophilic interaction/anion-exchange liquid chromatography tandem mass spectrometry (2019)
  • 著者名/発表者名: Kohta Nakatani1, Yoshihiro Izumi1, Masatomo Takahashi1, Keita Sakurai2, Michio Butsugan2, Takeshi Bamba1
  • 学会等名: 15th Annual Conference of the Metabolomics Society (Metabolomics 2019)
  • 国際学会
• [学会発表] シングルセル分子フェノタイプ解析に向けた基盤技術の創生 (2019)
  • 著者名/発表者名: 和泉 自泰1，松本 雅記1，山村 昌平2，馬場 健史1
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2019年大会 第70回日本電気泳動学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] シングルセルプロテオミクスに資する細胞回収前処理装置の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 秦 康祐1，和泉 自泰1，原 健士1，平藤 衛2，山村 昌平3，松本 雅記1，馬場 健史1
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2019年大会 第70回日本電気泳動学会総会
• [学会発表] 次世代メタボローム分析法：親水性相互作用/陰イオン交換クロマトグラフィータンデム質量分析の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 中谷 航太1，和泉 自泰1，高橋 政友1，櫻井 恵太2，佛願 道男2，○馬場 健史1
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2019年大会 第70回日本電気泳動学会総会
• [学会発表] 1細胞マルチ分子フェノタイピング技術の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 馬場 健史，和泉 自泰
  • 学会等名: 京都バイオ計測センター・京都大学ナノハブ拠点連携シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] 次世代メタボロミクスに向けた技術開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 和泉 自泰
  • 学会等名: JASIS 2019
  • 招待講演
• [学会発表] 質量分析を基盤としたシングルセル分子フェノタイプ解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 和泉 自泰，馬場 健史
  • 学会等名: 第71回 日本生物工学会大会
  • 招待講演
• [学会発表] 親水性相互作用/陰イオン交換クロマトグラフィータンデム質量分析による親水性代謝物の一斉 (2019)
  • 著者名/発表者名: 中谷 航太1，和泉 自泰1，高橋 政友1，櫻井 恵太2，佛願 道男2，馬場 健史1
  • 学会等名: 第71回 日本生物工学会大会
• [学会発表] 1細胞分子フェノタイプ解析に向けた基盤技術の創生 (2019)
  • 著者名/発表者名: 和泉 自泰，馬場 健史
  • 学会等名: Single Cellome Co-Innovators’Consortium 第1回 オープンフォーラム
  • 招待講演
• [学会発表] Unified HILIC/AEX/MS/MSによる新規メタボローム分析法の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 和泉 自泰1，中谷 航太1，櫻井 恵太2，佛願 道男2，馬場 健史1
  • 学会等名: 第13回 メタボロームシンポジウム
• [学会発表] Next-generation metabolomics: Technological development and medical application (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshihiro Izumi
  • 学会等名: The 4th Symposium of the Inter-University Research Network for Trans-Omics Medicine
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] System Development of a method for single-cell shotgun proteomics using highly sensitive nano-LC/MS/MS (2019)
  • 著者名/発表者名: Kousuke Hata1, Takeshi Hara1, Yoshihiro Izumi1, Masaki Matsumot2, 3, Takeshi Bamba1
  • 学会等名: HPLC 2019 Kyoto
  • 国際学会
• [学会発表] Exploring column performance of monolithic silica capillary columns and its application in nano-LC (2019)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Hara1, Kosuke Hata1, Yoshihiro Izumi1, Gino.V. Baron2, Takeshi Bamba1 and Gert
  • 学会等名: HPLC 2019 Kyoto
  • 国際学会
• [学会発表] Unified HILIC/AEX/MS/MSによる次世代メタボローム分析法の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 和泉 自泰1, 中谷 航太1, 高橋 政友1, 櫻井 恵太2, 佛願 道男2, 馬場 健史1
  • 学会等名: 第30回 クロマトグラフィー科学会議
• [産業財産権] 質量分析用標識組成物，代謝物の定量分析法，及び代謝物の動態解析法 (2019)
  • 発明者名: 脇村明夏里，寺内勉，馬場健史，和泉自泰，相馬悠希
  • 権利者名: 脇村明夏里，寺内勉，馬場健史，和泉自泰，相馬悠希
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2019-090121