1細胞メタボローム・プロテオーム分析によるがん細胞株の分子フェノタイプ解析

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K05167
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 和泉 自泰 九州大学, 生体防御医学研究所, 准教授 (70622166)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 1細胞メタボローム解析 / 1細胞プロテオーム解析 / シングルセル / 1細胞解析 / がん細胞

研究実績の概要

今年度は，1細胞試料から代謝物を包括的に観測するために新規のメタボローム分析法の開発を行った．具体的には，1~3級アミンおよび4級アンモニウム基を修飾したメタクリレートポリマー粒子を設計し，親水性相互作用と陰イオン交換作用を連続的に組み合わせた親水性相互作用/陰イオン交換クロマトグラフィー高分解能タンデム質量分析法 (unified hydrophilic interaction/anion exchange liquid chromatography tandem mass spectrometry, unified HILIC/AEX/MS/MS) を開発した．本手法は，陽イオン性，両イオン性，陰イオン性の極性代謝物を一斉にクロマト分離，MS検出可能な唯一の手法であり，従来法よりも再現性，網羅性の点で優れていることを実験的に示した．さらに，開発した充填剤を基にnano-LCカラムを作製することで高感度かつ網羅的な1細胞メタボローム分析法の確立に成功した．
また，1細胞プロテオーム分析法についてもカラム内径のダウンサイジングとイオン化の際のバックグラウンドイオンを低減させることによって，従来システムよりもより高感度かつ網羅的なプロテオーム情報が取得できるようになった．
さらに，細胞周期の進行をリアルタイムに観察可能なFucci (Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator) HeLa 細胞を使用して，細胞周期ごとの代謝物及びタンパク質の包括的かつ定量的な情報の取得を目指し予備検討を行った．予備検討の結果，細胞周期依存的な新規のタンパク質の同定に成功した．

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

昨年は1細胞メタボロームおよびプロテオーム分析法を達成するための要素技術を開発し， HeLa細胞から18種の親水性代謝物あるいは60種のタンパク質 (配列特異的なペプチド) を検出した．しかし，従来システムでは1細胞から取得可能な代謝物およびタンパク質の数はわずかであった．そこで，今年度は網羅性と検出感度を向上させるために1細胞分析システムの改良を行った．
1細胞メタボローム解析については，固定相の開発と各種分析条件の最適化を通して，HILICとAEXの分離モードが段階的に働く新しい液体クロマトグラフィーであるUnified HILIC/AEX分析法を考案した．その後，GL-HilicAex担体を充填した内径100μmのNano-LC分析カラムを用いてHeLa細胞の1細胞メタボローム解析を実施した．その結果1細胞からアミノ酸，核酸，補酵素を含む合計50種程度の代謝物の同定に成功し，従来法よりも網羅性が改善できた．1細胞プロテオーム分析についてはエレクトロスプレーイオン化 (ESI) 部分およびカラム内径のダウンサイジングを検討した．その結果，カラム内径を100μmから30μmにダウンサイジングし，Dream spray Nano-ESIを搭載することでHeLa1細胞から300種のタンパク質の同定・定量に成功した．
研究代表者は，1細胞チップにて各細胞を分離し，蛍光を指標に特性計測することで，異なる細胞タイプを定義・選定し，それらの細胞タイプの違いを代謝レベルで評価することを目指している．今年度は，細胞周期の進行をリアルタイムに観察可能なFucci HeLa 細胞を使用して，細胞周期ごとの代謝物及びタンパク質の包括的かつ定量的な情報の取得を行うための予備試験を行った．以上のことから，今年度は，当初の計画以上に研究が進展しているといえる．

今後の研究の推進方策

来年度は最終年度であるため，これまで開発してきた全ての要素技術を組み合わせた1細胞メタボローム・プロテオーム分析法を用いて，細胞周期ごとの代謝物およびタンパク質の包括的かつ定量的な情報を収集する．本研究により，細胞周期と代謝制御に関する新たな知見の取得を目指すとともに，細胞周期が同じ細胞集団中の細胞の不均一性について調査する．

次年度使用額が生じた理由

1細胞ピッキング装置の改良が予定していた金額よりも安く実施できたため73471円の繰越金が発生した．また次年度はNano-LC/MS装置を用いて多数の1細胞試料の測定を計画している．そのため，繰越金はNano-LC/MS分析を行うための消耗品費として使用する予定である．

研究成果

• [雑誌論文] Helicobacter metabolites exacerbate gastritis through C-type lectin receptors. (2021)
  • 著者名/発表者名: Nagata M, Toyonaga K, Ishikawa E, Haji S, Okahashi N, Takahashi M, Izumi Y, Imamura A, Takato K, Ishida H, Nagai S, Illarionov P, Stocker B L, Timmer M S M, Smith D G M, Williams S J, Bamba T, Miyamoto T, Arita M, Appelmelk B J, Yamasaki S*.
  • 雑誌名: J. Exp. Med. 巻: 218(1) ページ: e20200815
  • DOI: 10.1084/jem.20200815
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Glioma cells require one-carbon metabolism to survive glutamine starvation. (2021)
  • 著者名/発表者名: Tanaka K*, Sasayama T, Nagashima H, Irino Y, Takahashi M, Izumi Y, Uno T, Satoh N, Kitta A, Kyotani K, Fujita Y, Hashiguchi M, Nakai T, Kohta M, Uozumi Y, Shinohara M, Hosoda K, Bamba T, Kohmura E.
  • 雑誌名: Acta Neuropathol. Commun. 巻: 9 ページ: 16
  • DOI: 10.1186/s40478-020-01114-1
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Ddhd1 knockout mouse as a model of locomotive and physiological abnormality in familial spastic paraplegia. (2021)
  • 著者名/発表者名: Morikawa T, Ohishi H, Kosaka K, Shimojo T, Nagano A, Taniguchi I, Fujioka R, Moriyama K, Unoki M, Takahashi M, Nakao M, Izumi Y, Bamba T, Sasaki H, Miura S, Shibata H*.
  • 雑誌名: Biosci. Rep. 巻: 41(2) ページ: BSR20204171
  • DOI: 10.1042/BSR20204171
  • 査読あり
• [雑誌論文] Metabolic alteration of Methylococcus capsulatus str. Bath during a microbial gas-phase reaction. (2021)
  • 著者名/発表者名: Chen Y-Y#, Soma Y#, Ishikawa M#, Takahashi M, Izumi Y, Bamba T, Hori K*.
  • 雑誌名: Bioresour. Technol. 巻: 330 ページ: 125002
  • DOI: 10.1016/j.biortech.2021.125002
  • 査読あり
• [雑誌論文] Calibration-curve-locking database for semi-quantitative metabolomics by gas chromatography/mass spectrometry. (2021)
  • 著者名/発表者名: Hata K#, Soma Y#, Yamashita T, Takahashi M, Sugitate K, Serino T, Miyagawa H, Suzuki K, Yamada K, Kawamukai T, Shiota T, Izumi Y*, Bamba T*.
  • 雑誌名: Metabolites 巻: 11(4) ページ: 207
  • DOI: 10.3390/metabo11040207
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 1細胞メタボローム解析の現状 (2021)
  • 著者名/発表者名: 和泉自泰*，馬場 健史．
  • 雑誌名: 医学のあゆみ 巻: 276(10) ページ: 927-932
• [雑誌論文] Method for structural determination of lipid-derived radicals. (2020)
  • 著者名/発表者名: Matsuoka Y, Izumi Y, Takahashi M, Bamba T, Yamada KI*.
  • 雑誌名: Anal. Chem. 巻: 92(10) ページ: 6993-7002
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.0c00053
  • 査読あり
• [雑誌論文] Eicosapentaenoic acid attenuates renal lipotoxicity by restoring autophagic flux. (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto T, Takabatake Y*, Minami S, Takahashi A, Sakai S, Fujimura R, Takahashi A, Namba-Hamano T, Matsuda J, Kimura T, Matsui I, Kaimori J, Takeda H, Takahashi M, Izumi Y, Bamba T, Matsusaka T, Niimura F, Yanagita M, Isaka Y.
  • 雑誌名: Autophagy 巻: 28 ページ: 1-14
  • DOI: 10.1080/15548627.2020.1782034
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of a novel method for polar metabolite profiling by supercritical fluid chromatography/tandem mass spectrometry. (2020)
  • 著者名/発表者名: Konya Y, Izumi Y, Bamba T*.
  • 雑誌名: J. Chromatogr. A 巻: 1632 ページ: 461587
  • DOI: 10.1016/j.chroma.2020.461587
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dynamic metabolome analysis reveals the metabolic fate of medium-chain fatty acid in AML12 cells. (2020)
  • 著者名/発表者名: Fushimi T, Izumi Y*, Takahashi M, Hata K, Murano Y, Bamba T.
  • 雑誌名: J. Agric. Food Chem. 巻: 68(43) ページ: 11997-12010
  • DOI: 10.1021/acs.jafc.0c04723
  • 査読あり
• [雑誌論文] 超臨界流体クロマトグラフィー質量分析を基盤とした定量リピドーム分析法の開発． (2020)
  • 著者名/発表者名: 和泉自泰*，馬場健史．
  • 雑誌名: 生物工学 巻: 98(9) ページ: 490-493
• [雑誌論文] ω-3 脂肪酸含有脂質を識別する定量リピドーム解析技術． (2020)
  • 著者名/発表者名: 竹田浩章，和泉自泰，馬場 健史*．
  • 雑誌名: バイオインダストリー 巻: 37(10) ページ: 32-40
• [雑誌論文] アルコール代謝研究の最新動向． (2020)
  • 著者名/発表者名: 和泉自泰*．
  • 雑誌名: 生物工学 巻: 98(11) ページ: 622
• [学会発表] 親水性代謝物のワイドターゲットメタボローム分析のプロトコル (2021)
  • 著者名/発表者名: ○和泉 自泰
  • 学会等名: 日本農芸化学会 2021年度大会
  • 招待講演
• [学会発表] 高感度ナノ液体クロマトグラフィータンデム質量分析を基盤とした動物細胞のシングルセルメタボローム分析 (2020)
  • 著者名/発表者名: ○中谷 航太，和泉 自泰，秦 康祐，馬場 健史
  • 学会等名: 第68回質量分析総合討論会
• [学会発表] ノンターゲットメタボロミクスに向けた基盤技術開発 (2020)
  • 著者名/発表者名: ○和泉 自泰，鳥越 大平，富安 範行，中谷 航太，高橋 政友，馬場 健史
  • 学会等名: 第68回質量分析総合討論会
• [学会発表] イオンクロマトグラフィー四重極オービトラップ型高分解能質量分析 (IC/HRMS/MS) を用いた次世代メタボローム分析法の開発 (2020)
  • 著者名/発表者名: ○高橋 政友1，和泉 自泰1，鈴木 隆弘2，中谷 航太1，秦 康祐1，高原 健太郎2，馬場 健史1
  • 学会等名: 第68回質量分析総合討論会
• [学会発表] Exploratory approaches to highly-sensitive analysis toward single-cell shotgun proteomics using nano-LC/MS/MS (2020)
  • 著者名/発表者名: ○Kosuke Hata1, Takeshi Hara1, Yoshihiro Izumi1, Masaki Matsumoto1,2, Takeshi Bamba1
  • 学会等名: 68th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics
  • 国際学会
• [学会発表] Single-cell metabolomics of hydrophilic metabolites in typical mammalian cells based on highly sensitive nano-liquid chromatography tandem mass spectrometry (2020)
  • 著者名/発表者名: ○Kohta Nakatani, Yoshihiro Izumi, Kosuke Hata, Takeshi Bamba
  • 学会等名: 68th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics
  • 国際学会
• [学会発表] 次世代のメタボローム計測 (2020)
  • 著者名/発表者名: ○和泉 自泰
  • 学会等名: 生物工学会バイオ計測サイエンス研究部会2020 シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] ナノ液体クロマトグラフィー質量分析を基盤としたシングルセル分子フェノタイプ解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: ○和泉 自泰
  • 学会等名: CBI Annual Meeting 2020
  • 招待講演
• [学会発表] 免疫受容体に対する新規脂質リガンド探索のための解析プラットフォームの開発 (2020)
  • 著者名/発表者名: ○富安 範行1，和泉 自泰1,2，髙橋 政友2，西村 直矢3，豊永 憲司3，山崎 晶3，馬場 健史1,2
  • 学会等名: 生物工学若手研究者の集い 第三回 オンラインセミナー