研究課題
超解像顕微鏡法は、光学顕微鏡の空間分解能の理論限界である光の回折限界を超えた高空間分解能観察を実現する蛍光顕微鏡手法である。従来の超解像顕微鏡法には、低いパワー密度の照明を用いて生体試料に対する光毒性発生を最小限に抑えながら、高い密度の蛍光プローブを含む蛍光試料から良好な忠実度の超解像画像が得られる手法がこれまでなかった。本研究では、高生体適合性超解像イメージング法であるSPoD-OnPAN（super-resolution polarization demodulation/on-state polarization angle narrowing）を発展させ、蛍光物体からの蛍光強度揺らぎを含む画像の統計処理とSPoD-OnSPAN法を組み合わせることで、生体試料に対する光ダメージが少なく、忠実性の高い超解像画像を得られる超解像イメージング法を開発する。今年度は、高次統計量であるキュムラントを用いた画像再構成の検討を行った。蛍光色素からの蛍光強度揺らぎをマルコフモデルによってシミュレートした時系列画像を作成し、再構成画像を解析した。これにより、カメラセンサー上の1画素がカバーする蛍光色素の数が多ければ多いほど高次キュムラント画像の忠実性が低下した。また、蛍光色素の蛍光強度揺らぎは、On状態・Off状態の滞在時間が同程度となる条件で再構成画像の忠実度が高くなることが明らかになった。さらに、本研究から派生した展開研究として、SPoD-OnSPAN顕微鏡に対して全反射蛍光顕微鏡タイプのPALM超解像イメージングが可能な改変を行い、PALM超解像イメージングを行った。
2: おおむね順調に進展している
本研究の目的は、高生体適合性超解像イメージング法であるSPoD-OnPANを発展させ、蛍光物体からの蛍光強度揺らぎを含む画像の高次統計解析とSPoD-OnSPAN法を組み合わせることで、生体試料に対する光ダメージが少なく、忠実性の高い超解像画像を得られる超解像イメージング法を開発することである。今年度は、高次キュムラント画像の忠実性と蛍光色素の蛍光強度揺らぎとの相関についての解析を行った。さらにSPoD-OnSPAN顕微鏡で新規開発した光スイッチング蛍光タンパク質のイメージングのための評価も行った。以上より、今年度は研究計画にほぼ沿った研究内容を実施できた。
次年度は、本研究で開発する超解像顕微鏡で測定される画像データから、超解像画像を再構成する計算手法の開発を行う。当初計画している超解像画像再構成計算の方法では、入力画像データから、蛍光強度揺らぎの高次キュムラント画像をSPoD-OnPAN観察における照明光の偏光方向の角度の関数として求め、次いで、正則化最尤法によって試料面上の蛍光プローブ空間分布の推定計算を行う手順である。この計算手順での画像再構成計算の原理確認をした後、アルゴリズム全体の見直しを行い、より効率的な超解像画像再構成計算手法の開発を検討する。さらに、高次キュムラントの理論に基づいて忠実度の高い再構成画像を得る観察メソッドの開発を検討する。特に、観察下の蛍光タンパク質に対してスイッチング光を照射することで蛍光強度揺らぎを増強可能であると期待されるので、これを利用して高次キュムラント画像のコントラストの増強を図る。
今年度は、主に高次キュムラント画像のシミュレーションに重点をおいて研究を実施したために、実験用消耗品の支出が当初の予定よりも少なくなった。次年度使用額については、次年度のイメージング実験に掛かる生化学消耗品で使用する予定である。
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