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2020 年度 実施状況報告書

プラズモン共鳴による光濃縮効果を用いた膜タンパクの結晶化

研究課題

研究課題/領域番号 19K05291
研究機関群馬大学

研究代表者

奥津 哲夫  群馬大学, 大学院理工学府, 教授 (20261860)

研究分担者 堀内 宏明  群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (00334136)
研究期間 (年度) 2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード金ナノ構造 / 表面プラズモン共鳴 / 膜タンパク質 / 結晶化 / バクテリオロドプシン / 光誘起結晶化
研究実績の概要

膜タンパク質としてバクテリオロドプシンを用いて、金ナノ構造を用いた光誘起結晶化実験を行った。バクテリオロドプシンは研究室で発現した。金ナノ構造は金イオンスパッタ装置を用い5nmの膜厚になるよう設定して作成した。ガラス基板の吸収・散乱スペクトルを測定し、金ナノ粒子のギャップ構造によるプラズモン共鳴が生じることを確認した。金ナノ構造を構築したガラス基板を用いてLCP-サンドイッチプレートを作成し、膜タンパク質の結晶化実験を行った。光は640nmの直線偏光を用いた。
金なし/光なしのコントロールでは4つのウェル中1ウェルで結晶が出現したが、金あり/光ありの条件では4個のウェルの2個で結晶が出現した。光を当てたウェルでは結晶数が多かった。塩濃度を2.0, 2.4, 2.7 Mの三種類用いて結晶化実験を行った。最も塩濃度が低い条件では、金なし/光なしのコントロール、金あり/光ありの条件とも結晶は出現しなかった。2.4,2.7Mの時には、コントロールよりも金あり/光ありで出現した結晶のサイズが大きくなり数も多くなった。
コントロールでは28日経過しても結晶が出現しなかったが、金あり/光なしで28日経過後に結晶が出現した。金あり/光ありでは14日後に結晶が出現した。このことから、金ナノ構造と光照射の組み合わせにより結晶化が誘起されることを確認した。
水溶性タンパク質の実験で、金ナノ構造にタンパク質が吸着すること、光照射によりさらに吸着量が増加することを確認している。金ナノ構造のギャップにタンパク質が濃縮されここで結晶化が始まると考えている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

膜タンパク質を積極的に結晶化する研究はほとんど例がなく、チャレンジングな試みである。我々は今までに入手可能な水溶性タンパク質を購入し実験してきたが、膜タンパク質は売っているものがなく、自分で発現して実験することから始めるしかない。最初にタンパク質の発現という問題をクリヤすることが第一歩だが、これを乗り越えることができたので順調といえる。しかしながら、発現実験の際に学科共通で使っている遠心分離機が何度もトラブルを起こし、その都度実験がストップしてしまうなどの問題に向き合う必要があった。
次に結晶化実験について述べる。水溶性タンパク質の結晶化に関しては、主にリゾチームを用いて結晶化の物理化学的な観点による研究が行われてきた。一方膜タンパク質の結晶化実験は、「結晶を出す」だけに留まる実験の段階で、物理化学的に結晶化を議論した例がない。このような現状で、金ナノ構造と光照射による膜タンパク質の結晶化誘起効果を定量的に議論するのは困難であると思われたが、幸運にも金ナノ構造と光照射による効果が明確に異なる結果を得ることができた。
タンパク質の発現実験に半年を要することから、この実験は2年間に2回しか行うことができない。2回ともポジティブな結果が得られたことから概ね順調であるといえる。

今後の研究の推進方策

実験は二度の再現性をとることができたので、信頼できるものとする。今後はこの分野の研究動向を調査し、論文執筆にとりかかる。
また、この現象がなぜ起こるのかについての機構の解明を進める。

次年度使用額が生じた理由

コロナ禍の影響で学会出張がなかった。そのため出張費の支出がなく、当初予定していた予算を使い切ることができなかった。余った予算は次年度の実験費用として使用する。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2020

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (8件) 図書 (1件)

  • [雑誌論文] Crystal nucleation of proteins induced by surface plasmon resonance2020

    • 著者名/発表者名
      Tetsuo Okutsu
    • 雑誌名

      Advances in Organic Crystal Chemistry Comprehensive Reviews

      巻: - ページ: 71-79

    • DOI

      10.1007/978-981-15-5085-0_4

    • 査読あり
  • [学会発表] 近赤外光線力学療法・光線力学診断への応用を指向したトリプルpH応答性光増感剤2020

    • 著者名/発表者名
      堀内宏明・田島和哉・奥津哲夫
    • 学会等名
      2020年web光化学討論会
  • [学会発表] 腫瘍特異的な光増感を目指したGSH活性化可能なシリルポルフィリンダイマーの研究2020

    • 著者名/発表者名
      住谷有沙・堀内宏明・武藤慎吾・奥津哲夫
    • 学会等名
      2020年web光化学討論会
  • [学会発表] 光線力学療法への応用を目指したシリルポルフィリン-含硫糖複合体の開発2020

    • 著者名/発表者名
      西川昂汰・堀内宏明・大重真彦・松尾一郎・菅原二三男・坂口謙吾・桂進司・吉原利忠・飛田成史・奥津哲夫
    • 学会等名
      2020年web光化学討論会
  • [学会発表] 腫瘍特異的な光増感を目指したGSHにより活性化可能なシリルポルフィリンダイマーの研究2020

    • 著者名/発表者名
      住谷有沙・堀内宏明・武藤慎吾・奥津哲夫
    • 学会等名
      第10回CSJ化学フェスタ
  • [学会発表] ポルフィリンのトリプルpH応答性におけるアミノインドール置換数の及ぼす影響2020

    • 著者名/発表者名
      蟹和勇人・堀内宏明・田島和哉・奥津哲夫
    • 学会等名
      2020年web光化学討論会
  • [学会発表] 金コア/パラジウムシェルナノ粒子による表面プラズモン共鳴を用いたタンパク質結晶化2020

    • 著者名/発表者名
      横山諒・伊藤明日香・田倉章浩・天日勝也・粕谷豊・掘内宏明・奥津哲夫
    • 学会等名
      2020年web光化学討論会
  • [学会発表] "表面プラズモン共鳴を利用したタンパク質光誘起結晶化に求められる光の性質 "2020

    • 著者名/発表者名
      佐藤友彦・堀内宏明・奥津哲夫・田倉章浩・天日勝也・粕谷豊
    • 学会等名
      2020年web光化学討論会
  • [学会発表] 金コア/パラジウムシェルナノ粒子による表面プラズモン共鳴を用いたタンパク質結晶化2020

    • 著者名/発表者名
      横山諒・伊藤明日香・田倉章浩・天日勝也・粕谷豊・掘内宏明・奥津哲夫
    • 学会等名
      第10回CSJ化学フェスタ
  • [図書] Advances in Organic Crystal Chemistry Comprehensive Reviews 20202020

    • 著者名/発表者名
      Tetsuo Okutsu
    • 総ページ数
      537
    • 出版者
      Springer
    • ISBN
      978-981-15-5084-3

URL: 

公開日: 2021-12-27   更新日: 2023-03-16  

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