| 研究課題/領域番号 |
19K05524
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
山本 茂樹 大阪大学, 理学研究科, 助教 (60552784)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | キラリティ / 低波数 / テラヘルツ / タンパク質構造 |
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| 研究実績の概要 |
溶液中タンパク質の高次構造を簡便に測定することは，タンパク質の機能を理解する上で重要である。太古に起こった生物の単一キラリティ選択により，タンパク質は一般的に L-アミノ酸からなり，その鏡像異性体であるD-アミノ酸は含まない。このため，例えばαヘリックス二次構造は常に右巻きの螺旋構造をとるように，二次構造もキラルとなっている。さらに高次のタンパク質構造や溶媒和構造もキラルとなりうるが，それらキラル高次構造を溶液中において直接かつ簡便に測定することは依然難しい。本研究においては，180 cm-1以下の低波数領域においてラマン光学活性（Raman Optical Activity; ROA）を測定し，溶液中タンパク質のキラル高次構造を直接に解析でき，かつ既存のROAよりも高感度な分析法を開発することを目指した。
水溶液中において左巻きのPP-IIヘリックス二次構造をとるコラーゲンモデルペプチドの低波数ROAスペクトルを初めて測定した。他の螺旋二次構造をとるタンパク質と同様に，100 cm-1付近に高波数領域と比べて数倍強いキラル信号が観測された。量子力学と分子動力学を用いたスペクトル計算により，低波数実験スペクトルを良く再現することに成功した。この解析によって，これまで未知であった低波数ピークの帰属を達成し，さらには低波数ROAのピーク幅はペプチドの構造揺らぎに鋭敏を反映することを明らかとした。
装置開発を行い，これまで測定不可能であった35 cm-1付近までの低波数ROA測定を可能とした。標準的なキラル試料の両異性体の測定を行い，35 cm-1付近まで正しく測定できることを確かめた。この新規な極低波数ROA装置を用いて，今後，結晶構造が既知のタンパク質を測定し，極低波数領域に現れうる高強度キラル信号と，タンパク質キラル高次構造との関連を解析してゆく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
溶液中でPP-IIヘリックス構造をとるコラーゲンモデルペプチドの低波数ROA測定を行い，従来の高波数領域（800 cm-1以上）と比べて5-10倍のキラル信号を示すことを明らかとしたことは，新たな高感度キラル測定法の開発の観点から大きな進捗である。さらに，分子断片化法を用いた量子力学および分子動力学計算により，コラーゲンモデルペプチドの高強度な低波数ROAスペクトルを良く再現することができた。相対強度および波数について，実験スペクトルと計算スペクトルが良く対応しており，高強度ROAピークの振動モードの帰属が可能となった。
実験スペクトルと計算スペクトルの比較から，コラーゲンモデルペプチドの高強度な低波数ROA信号は，アミド基平面に関した原子運動と側鎖が関連した非局在化した原子運動に帰属されることが分かった。さらに，分子動力学と量子力学計算を組み合わせた解析から，100 cm-1付近の高強度ROA信号のピーク幅は，溶液中ペプチドの構造揺らぎを反映することが明らかとなった。
これまでの低波数ROAの測定可能な波数範囲は，申請者らが以前に行った65 cm-1付近まであった。今回特殊な光学設計を採用することで，この下限を35 cm-1付近まで拡張することを達成した。これまでの低波数ROA信号に比べて，さらに高強度なキラル信号や，水分子との水素結合を反映したキラル信号を検出できる可能性がある。このことは，タンパク質のキラル高次構造の解析に限らず，より一般的なキラル計測法の開発の観点からも，大きな進展である。
以上の進展から，“当初の計画以上に進展している”と評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回開発した35 cm-1付近まで測定可能な極低波数ROA装置を用いて，結晶構造が既知であるタンパク質を測定し，高強度なキラル信号が観測されるのか調査する。種々のタンパクについて実験を行い，タンパク質構造（一次，二次，三次）と極低波数ROAスペクトルとの相関を明らかとする。多数のタンパク質の測定を行う。X線結晶構造解析により結晶中での構造が既知のタンパク質（アルブミン，アポフェリチン，インスリン，コンカナバリン，リゾチーム，IgG，βラクトグロブリンなど多数）について，溶液中において測定を行う。得られた低波数ROAピークの波数位置および強度を，既知の二次および三次構造と比較する。
さらに，三次以上の高次構造をほとんど取らないと予想される，単一のアミノ酸からなるポリペプチドを測定し，タンパク質の結果と比較することで，二次構造による効果と，三次以上の高次構造による効果とを分離帰属する。例えば，αヘリックスが規則的に配列した三次構造をとるアポフェリチンと，水溶液中でαヘリックス二次構造をとるポリ-L-グルタミン酸を比較すれば，アポフェリチンに特徴的な三次構造（規則的なαヘリックスの配列）由来のROAスペクトルが特定できる。
低波数ROAスペクトルの理論計算は，これまで繰り返し構造のあるポリペプチドに限定されてきた。これを初めてタンパク質へ応用し，実験スペクトルを理論計算により再現することで，低波数キラル信号の発生原因を明らかとする。そのために，他のタンパク質に比べて小さなインスリンについて，その極低波数ROAスペクトルを理論計算し，実験と比較する。
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