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令和2年度では、アセトニトリルをモノマーとしたナノ積層基板上のアミノ基とチオール標識一次アプタマーを結合させる架橋剤として、分子の各末端にマレイミド基とNHSエステル基を有するSulfo-EMCSを用いることで、非特異的な蛍光を抑制することに成功した。そこで最終年度では、アセトニトリル以外のモノマーを検討し、さらに標的分子に対する検出感度の評価を行った。
プラズマ重合を行う際のモノマーとして、アセトニトリル以外に、分子内にアミノ基を有するアリルアミン、シクロプロピルアミン、エチレンジアミンを用いてプラズマ重合膜を作製した。それぞれの膜上に蛍光標識DNAをスポッティングしたところ、最も高い蛍光増強効果が得られたのは、アセトニトリル膜であった。さらにアセトニトリルを用いたナノ積層基板でトロンビンを標的としたアプタマーサンドイッチアッセイを行ったところ、5-1000 nMで特異的な検出が可能であった。
補助事業期間全体を通じて、以下のような研究成果が得られた。まず①DNAアプタマーなどの分子認識素子を、アミノ基を有するナノ積層基板上に固定化する際は、グルタルアルデヒドのように官能基を１種類しか持たない1価性架橋剤ではなく、Sulfo-EMCSのような2価性架橋剤が有効であることが示された。また②これまで行っていなかったプラズマ重合を行う際の出力やモノマーの詳細な検討、またプラズマ重合膜の物性の化学的な評価を行うことで、よりプラズマ重合法に対する理解と応用への知見が深まった。さらに③蛍光増強効果により高感度なアプタマーサンドイッチアッセイが可能となった。
本研究の基盤技術であるナノ積層構造は、ガラス基板やマイクロプレートなど様々なフォーマットに構築可能であるため、本研究で得られた成果は蛍光測定による様々なバイオアッセイに応用でき、極めて意義深い。
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