油中液滴チャンバー法が可能にする1細胞プロテオミクスの開発

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K05544
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 増田 豪 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 助教 (70383940)
• 研究分担者: 宇都 甲一郎 国立研究開発法人物質・材料研究機構, 国際ナノアーキテクトニクス研究拠点, 独立研究者 (30597034)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: プロテオミクス / 高感度分析 / 1細胞オミクス / 油中液滴

研究実績の概要

タンパク質はDNAのように増幅することができない。そのため、1細胞プロテオミクスを実現するには、細胞から回収されたタンパク質をいかに損失することなく質量分析計に到達させるかがポイントとなる。申請者は、油中に形成した微少な液滴中でタンパク質の前処理をすることで、プラスチック容器との接面積が縮小し回収率が劇的に改善することを見出している。また、液滴にビーズを添加することで回収率が上昇することも見出している。本申請課題では、この油中液滴法を改良することで1細胞プロテオミクスの達成を目指している。
2019年度までは、あらかじめ抽出したタンパク質溶液やペプチド溶液を用いて油中液滴法の効果を評価してきた。実際に1細胞プロテオミクスを行う際には、細胞を初期試料として用いる。そこで2020年度は、細胞から油中液滴法を開始して回収率を溶液消化法と比較した。細胞はセルソーターで油中に直接射出導入した。100細胞を用いて油中液滴法を行った場合、従来法である溶液消化法と比べて回収率が約10倍に向上した。また、96-well plateで一度に60種類の試料についてパラレルで油中液滴法を行った。15種類の多発性骨髄腫細胞株について、10000細胞を用いた溶液消化法と100細胞を用いた油中液滴法で得られたプロテオミクスデータを比較した。UMAP解析を行ったところ、前処理方法が違っていても同じ細胞種同士が近傍に配置された。このことから、油中液滴法では、従来法と同等のプロテオミクスデータが得られることが示された。今年度も計画通りに進行しており、次年ではLC-MSの感度を向上させることで1細胞プロテオミクスを達成する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

細胞を初期試料として油中液滴法を行うことが確認され、油中液滴法の実用性が検証された点は非常に大きな前進であった。一方で、LC-MSの感度向上目標は達成されていない。また、油中液滴用容器の評価を実施していない。

今後の研究の推進方策

前処理の自動化を目的として、1536-well対応の液体ハンドリングロボットを導入した。2021年度は、当該ロボットを油中液滴法に最適化する。また、共同研究で作製している油中液滴用容器について回収率の評価を行う。最終的には前処理の自動化を行うことで、ハイスループットな1細胞プロテオミクスを達成する。

研究成果

• [雑誌論文] Efficient isolation of brain capillary from a single frozen mouse brain for protein expression analysis (2021)
  • 著者名/発表者名: Ogata Seiryo、Ito Shingo、Masuda Takeshi、Ohtsuki Sumio
  • 雑誌名: Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 巻: 41 ページ: 1026～1038
  • DOI: 10.1177/0271678X20941449
  • 査読あり
• [雑誌論文] In-vitro acetylation of SARS-CoV and SARS-CoV-2 nucleocapsid proteins by human PCAF and GCN5 (2021)
  • 著者名/発表者名: Hatakeyama Dai、Masuda Takeshi、Miki Ryosuke、Ohtsuki Sumio、Kuzuhara Takashi
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 557 ページ: 273～279
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2021.03.173
  • 査読あり
• [雑誌論文] Oral Coadministration of Zn-Insulin with d-Form Small Intestine-Permeable Cyclic Peptide Enhances Its Blood Glucose-Lowering Effect in Mice (2021)
  • 著者名/発表者名: Ito Shingo、Torii Yuta、Chikamatsu Shoma、Harada Tomonori、Yamaguchi Shunsuke、Ogata Seiryo、Sonoda Kayoko、Wakayama Tomohiko、Masuda Takeshi、Ohtsuki Sumio
  • 雑誌名: Molecular Pharmaceutics 巻: 18 ページ: 1593～1603
  • DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.0c01010
  • 査読あり
• [雑誌論文] Lysine Demethylase 5A is Required for MYC Driven Transcription in Multiple Myeloma (2021)
  • 著者名/発表者名: Ohguchi H, Park PMC, wang T, Gryder BE, Ogiya D, kurata K, zhang X, Li D, pei C, Masuda T, Johansson C, Wimalasena VK, Kim Y, Hino S, Usuki S, Kawano Y, Samur MK, Tai Y-T, Munshi NC, Matsuoka M, Ohtsuki S, Nakao M, Minami T, Lauberth S, Khan J, Oppermann U, Durbin AD, Anderson KC, Hideshima T, Qi J
  • 雑誌名: Blood Cancer Discovery 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1158/2643-3230.BCD-20-0108
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Quantitative and targeted proteomics-based identification and validation of drug efficacy biomarkers (2021)
  • 著者名/発表者名: Masuda Takeshi、Mori Ayano、Ito Shingo、Ohtsuki Sumio
  • 雑誌名: Drug Metabolism and Pharmacokinetics 巻: 36 ページ: 100361～100361
  • DOI: 10.1016/j.dmpk.2020.09.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] SHOC2 Is a Critical Modulator of Sensitivity to EGFR-TKIs in Non-Small Cell Lung Cancer Cells (2020)
  • 著者名/発表者名: Terai Hideki、Hamamoto Junko、Emoto Katsura、Masuda Takeshi、Manabe Tadashi、Kuronuma Satoshi、Kobayashi Keigo、Masuzawa Keita、Ikemura Shinnosuke、Nakayama Sohei、Kawada Ichiro、Suzuki Yusuke、Takeuchi Osamu、Suzuki Yukio、Ohtsuki Sumio、Yasuda Hiroyuki、Soejima Kenzo、Fukunaga Koichi
  • 雑誌名: Molecular Cancer Research 巻: 19 ページ: 317～328
  • DOI: 10.1158/1541-7786.MCR-20-0664
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Proteomic Evaluation of Plasma Membrane Fraction Prepared from a Mouse Liver and Kidney Using a Bead Homogenizer: Enrichment of Drug-Related Transporter Proteins (2020)
  • 著者名/発表者名: Yagi Ryotaro、Masuda Takeshi、Ogata Seiryo、Mori Ayano、Ito Shingo、Ohtsuki Sumio
  • 雑誌名: Molecular Pharmaceutics 巻: 17 ページ: 4101～4113
  • DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.0c00547
  • 査読あり
• [雑誌論文] Convenient method of producing cyclic single-chain Fv antibodies by split-intein-mediated protein ligation and chaperone co-expression (2020)
  • 著者名/発表者名: Liu Chenjiang、Kobashigawa Yoshihiro、Yamauchi Soichiro、Fukuda Natsuki、Sato Takashi、Masuda Takeshi、Ohtsuki Sumio、Morioka Hiroshi
  • 雑誌名: The Journal of Biochemistry 巻: 168 ページ: 257～263
  • DOI: 10.1093/jb/mvaa042
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effects of differences in pre-analytical processing on blood protein profiles determined with SWATH-MS (2020)
  • 著者名/発表者名: Nambu Madoka、Nishiumi Shin、Kobayashi Takashi、Masuda Takeshi、Ito Shingo、Yoshida Masaru、Ohtsuki Sumio
  • 雑誌名: Journal of Proteomics 巻: 223 ページ: 103824～103824
  • DOI: 10.1016/j.jprot.2020.103824
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nicotine promotes angiogenesis in mouse brain after intracerebral hemorrhage (2020)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto Kosei、Kinoshita Keita、Hijioka Masanori、Kurauchi Yuki、Hisatsune Akinori、Seki Takahiro、Masuda Takeshi、Ohtsuki Sumio、Katsuki Hiroshi
  • 雑誌名: Neuroscience Research 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1016/j.neures.2020.07.003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Laminin Subunit Alpha-4 and Osteopontin Are Glioblastoma-Selective Secreted Proteins That Are Increased in the Cerebrospinal Fluid of Glioblastoma Patients (2020)
  • 著者名/発表者名: Kohata Tomohiro、Ito Shingo、Masuda Takeshi、Furuta Takuya、Nakada Mitsutoshi、Ohtsuki Sumio
  • 雑誌名: Journal of Proteome Research 巻: 19 ページ: 3542～3553
  • DOI: 10.1021/acs.jproteome.0c00415
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of Cell-Surface Proteins Endocytosed by Human Brain Microvascular Endothelial Cells In Vitro (2020)
  • 著者名/発表者名: Ito Shingo、Oishi Mariko、Ogata Seiryo、Uemura Tatsuki、Couraud Pierre-Olivier、Masuda Takeshi、Ohtsuki Sumio
  • 雑誌名: Pharmaceutics 巻: 12 ページ: 579～579
  • DOI: 10.3390/pharmaceutics12060579
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Novel cyclic peptides facilitating transcellular blood-brain barrier transport of macromolecules in vitro and in vivo (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi Shunsuke、Ito Shingo、Masuda Takeshi、Couraud Pierre-Olivier、Ohtsuki Sumio
  • 雑誌名: Journal of Controlled Release 巻: 321 ページ: 744～755
  • DOI: 10.1016/j.jconrel.2020.03.001
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] 高感度・高精度なプロテオミクス技術 (2021)
  • 著者名/発表者名: 増田豪
  • 学会等名: 日本薬学会第141年会
• [学会発表] 油中液滴法を用いた100細胞プロテオミクスの有効性 (2020)
  • 著者名/発表者名: 稲森悠真、増田豪、伊藤慎悟、大槻純男
  • 学会等名: 日本薬物動態学会第35年会