|
βペプチドは、αペプチドの長所を維持しつつ易分解性を改良した材料であり生体内などでの利用が期待される。申請者が発見したβペプチド分解酵素は、その反応可逆性によってバイオマス由来のアスパラギン酸から新奇なβペプチドであるβポリアスパラギン酸(β-PAA)を合成できる。しかし、この系の反応効率は高くないため、合成に最適な酵素の獲得・創成が必要である。一方、現在使用可能な全ての酵素は、環境中の培養可能な1 %未満の微生物から得られたものであり、残り99 %の微生物資源の有効利用が望まれている。そこで本研究では、環境試料から直接DNAを抽出してメタゲノムライブラリを作製し、βペプチド分解活性を指標としたスクリーニングを行い、難培養微生物由来新規βペプチド分解酵素の獲得を目的とする。さらに、βペプチド骨格を有する機能性材料開発を指向した酵素の高性能化・高機能化を目指す。
前年度において、環境DNAの品質や低断片化DNAの除去が良質なライブラリ作製には肝要であることが示唆された。そこで本年度は、まず、大腸菌を宿主としたメタゲノムスクリーニングを目的とした良質なライブラリ作製を試みた。効率的に分解酵素の獲得を可能とするため、採取した環境試料(土壌や河川水)で目的ポリマーの生分解実験を行い、十分に生分解が進行した環境試料溶液中のバイオフィルムからDNAを分離精製することとした。生分解後の溶液からバイオフィルムを遠心分離で回収し、そこからDNAを精製した。また、DNA増幅時によるDNAの低品質化を避けるため、精製DNAは増幅せずに用いた。さらに、低断片化DNAを電気泳動で除去してライブラリ作製に用いた。得られたライブラリを解析したところ、低断片化DNAの挿入が抑制され、ほとんどが2.5kbp以上であり、最も大きいもので24kbpの断片が挿入されており、良質なライブラリの作製方法を構築できた。
|
