多様な点突然変異に対応する人工核酸の設計と難治性がん治療への応用

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K05584
• 研究機関: 鳥取大学
• 研究代表者: 櫻井 敏彦 鳥取大学, 工学研究科, 准教授 (10332868)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: ペプチド核酸 / ヒポキサンチン / KRAS遺伝子変異 / 一塩基多型 / 相補鎖形成挙動

研究実績の概要

InosineはD-リボースとHypoxanthine (Hyp) からなるヌクレオシドで, Guanine以外のCytosine , Adenine, Thymineと塩基対を形成する“ゆらぎ塩基”として作用する. つまり, Gを除く塩基を網羅的に検出できる機能性官能基として, 一塩基多型（SNP）を原因とする疾患（ここでは，がん疾患の初期段階で見られるKRAS遺伝子一塩基変異群 (GGT (WT) ⇒ GCT, GAT, GTT)） のプロービングや遺伝子治療薬への展開を目的としている. 今年度は, 前述のKRAS遺伝子一塩基変異群の網羅的な検出を目的として, ペプチド核酸 (Peptide Nucleic Acid; PNA) の側鎖にHypoxanthineを導入したPNAモノマーの合成と，そのモノマーを用いたoligo PNA (Ac-CAHCAGCT-NH2) を合成した.
8段階の合成により，目的とするFmoc-Hyp(Bn)-OHを得た (ESI-MS: obs. = 607.23 (cal. Mw = 606.63), 純度: 95.0%, 収率: 22.8%). 得られたFmoc-Hyp(Bn)-OHを用いてoligo PNA (Ac-CAHCAGCT-NH2)を合成した結果, TOF-MS測定 (obs. = 607.23, cal. Mw = 606.63) ならびにHPLC測定 (純度: 95.0%) より目的とするoligo PNAが合成されたことが確認された (収率: 17.1%).

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本申請では，Hypを側鎖に持つペプチド核酸を合成し，1塩基認識能を誘起するi-PPCにHypを組み込むことにより，KRAS遺伝子のexon2codon12に見られる点突然変異とi-PPCの相補鎖形成挙動を解析，KRAS遺伝子変異をもつ各種すい臓がん細胞の細胞死誘導ならびに細胞死メカニズムについて解明する研究計画を立てている．
細目では下記の項目を計画しており，項目1（Hypを側鎖に持つi-PPCの合成と物性評価）では，a)Hyp基の6位をベンジル基で保護したPNAモノマー（Fmoc-Hyp(OBn)-OH）の合成，b)マイクロウェーブ合成機を利用したFmoc-Hyp(OBn)-OHからのi-PPC(Hyp)の合成，c)細胞内輸送挙動の解析を目的とした蛍光ラベル化i-PPCの合成，d)KRAS遺伝子のexon2codon12に見られる点突然変異とi-PPCの相補鎖形成挙動の解析．
項目2（KRAS遺伝子を標的としたi-PPC(Hyp)による変異型細胞の網羅的な細胞死誘導とそのメカニズムの解析）では，a)蛍光ラベル化したi-PPC(Hyp)を用いた細胞内輸送挙動の評価，b)i-PPC(Hyp)による各種すい臓がん細胞の細胞死誘導，c)フローサイトメーターを利用した細胞死メカニズムの解明，を計画していた．
今年度は，項目1のa)-c)が達成されたこととなるため，進捗状況は”(2) おおむね順調に進展している”と判断した．

今後の研究の推進方策

先の進捗状況について，下記の項目を達成したことを報告した．
項目１（Hypを側鎖に持つi-PPCの合成と物性評価），a)Hyp基の6位をベンジル基で保護したPNAモノマー（Fmoc-Hyp(OBn)-OH）の合成，b)マイクロウェーブ合成機を利用したFmoc-Hyp(OBn)-OHからのi-PPC(Hyp)の合成，c)細胞内輸送挙動の解析を目的とした蛍光ラベル化i-PPCの合成．
達成した項目1)-a)について，目的とするFmoc-Hyp(Bn)-OHを得ることができたものの，その収率は低く（22.8%），今後の研究遂行のためにはより高い収量が求められる．このため，今後の推進方策の一つとして，Fmoc-Hyp(Bn)-OHの収率向上をはかることとした．この点を踏まえ，項目１（Hypを側鎖に持つi-PPCの合成と物性評価）の細目：d)KRAS遺伝子のexon2codon12に見られる点突然変異とi-PPCの相補鎖形成挙動の解析，ならびに，項目2（KRAS遺伝子を標的としたi-PPC(Hyp)による変異型細胞の網羅的な細胞死誘導とそのメカニズムの解析），a)蛍光ラベル化したi-PPC(Hyp)を用いた細胞内輸送挙動の評価，を2020年度の進捗目標と設定した．

研究成果

• [雑誌論文] Reductive coupling of phthalic anhydrides with aliphatic ketones by low-valent titanium: Unusual two-to-one coupling for preparation of 3,3-disubstituted phthalides (2020)
  • 著者名/発表者名: Kise Naoki、Yamamoto Shota、Sakurai Toshihiko
  • 雑誌名: Tetrahedron 巻: 76 ページ: 130820～130820
  • DOI: 10.1016/j.tet.2019.130820
  • 査読あり
• [雑誌論文] Electroreductive Intermolecular Coupling of 4-Quinolones with Benzophenones: Synthesis of 2-Substituted 4-Quinolones (2019)
  • 著者名/発表者名: Kise Naoki、Yoshimura Yoshie、Manto Tatsuhiro、Sakurai Toshihiko
  • 雑誌名: ACS Omega 巻: 4 ページ: 20080～20093
  • DOI: 10.1021/acsomega.9b03342
  • 査読あり
• [雑誌論文] Reductive coupling of aliphatic cyclic imides and ω-amidoesters with benzophenones by low-valent titanium: Synthesis of 5-diarylmethylene-1,5-dihydropyrrol-2-ones, 6-diarylmethyl-2-pyridones, and ω-(diarylmethylene)lactams (2019)
  • 著者名/発表者名: Kise Naoki、Kinameri Syn、Sakurai Toshihiko
  • 雑誌名: Tetrahedron 巻: 75 ページ: 3553～3569
  • DOI: 10.1016/j.tet.2019.05.013
  • 査読あり
• [雑誌論文] Electroreductive Intermolecular Coupling of Chromones with Benzophenones: Synthesis of 2-Diarylmethylchromones and Tetrasubstituted Furans (2019)
  • 著者名/発表者名: Kise Naoki、Nagamine Hiroaki、Sakurai Toshihiko
  • 雑誌名: European Journal of Organic Chemistry 巻: 2019 ページ: 3662～3676
  • DOI: 10.1002/ejoc.201900519
  • 査読あり
• [学会発表] 難治性がん治療を目指した核酸医薬の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 櫻井 敏彦
  • 学会等名: PHOENICSシンポジウム特別講演会
  • 招待講演
• [学会発表] 細胞内で1塩基変異を認識する人工遺伝子の開発 ～難治性がん疾患治療薬への応用をめざして～ (2019)
  • 著者名/発表者名: 櫻井 敏彦
  • 学会等名: 関西大学先端科学技術推進機構 研究部門別発表会（第59回）
  • 招待講演
• [学会発表] Inchworm 型人工核酸による遺伝子変異性がん細胞の誘導死効果 (2019)
  • 著者名/発表者名: 濱下 優介, 木瀬 直樹, 櫻井 敏彦
  • 学会等名: 第68 回高分子学会年次大会
• [学会発表] リソソーム内分解酵素を利用した細胞内薬物徐放に関する研究 (2019)
  • 著者名/発表者名: 吉田 裕紀 江原 麻紀 ，木瀬 直樹 ，櫻井 敏彦
  • 学会等名: 第34回中国四国高分子若手研究会