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本研究計画では、研究代表者らが以前に開発したBiFC/GFP-Trapシステムを応用し、タンパク質ユビキチン化修飾の検出および機能解析を簡便・高精度に行える技術「BiFC/GFP-Trapユビキチン化解析システム」の開発を目的としている。この新規解析法では、タンパク質相互作用検出法であるBiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation)とユビキチン結合プローブのTUBEを組み合わせることで、これまでの抗体を用いた解析方法等と比較して、簡便に細胞内タンパク質ユビキチン化の検出が実現可能である。さらに、TUBEをその他のタンパク質翻訳後修飾認識ドメインに置き換えることで、多彩なタンパク質修飾に対応できる可能性を有している。
ユビキチン化の標的として、これまでにユビキチン化分子機構の詳細が分かっているタンパク質であるIkappaBalphaとp53を用い、本解析システムの適用を試みた。これまでに、構築したユビキチン結合プローブTUBEと標的タンパク質との組み合わせのBiFCコンストラクトを用い、ユビキチン化シグナル検出の最適化を比較検討した。これらを発現させた細胞において、IkappaBalphaおよびp53ユビキチン化体の蓄積を検討した。その結果、それぞれの標的タンパク質およびTUBEのN末端またはC末端側へのBiFC蛍光タンパク質の付加を比較した組み合わせにおいて、BiFCの蛍光シグナルすなわち標的タンパク質のユビキチン化を期待通りに変化させる組み合わせがあることを明らかにした。これらの条件において、ウエスタンブロット法による検証でユビキチン化を示すラダー状パターンのシグナルの検出を行い、実際にユビキチン化体の増加とBiFCシグナルに相関が見られることを確認し、計画した解析システムが想定通りに機能することが分かった。
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