ストップトフロー共鳴ラマン分光法によるヘム含有2原子酸素添加酵素の反応機構研究

2021 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19K05698
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 柳澤 幸子 兵庫県立大学, 理学研究科, 准教授 (60557982)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 2原子酸素添加酵素 / ヘム酵素 / stopped-flow / 共鳴ラマン分光法 / 可視紫外吸収分光法

研究実績の概要

ヒトインドールアミン2,3ジオキシゲナーゼ1(IDO)はトリプトファン(Trp)主要代謝経路の最初の反応を触媒する。この反応はヘム酵素による唯一の2原子酸素添加反応で、ヘム酵素として特異な反応と言える。４価ヘム鉄に酸素が一つ配位したフェリルオキソ種が反応中間体として報告されたため、1回の2原子酸素添加反応ではなく2回の１原子酸素添加反応と捉えられるようになったが、反応機構全容は不明である。本研究では、ストップトフロー共鳴ラマン分光法を用い、反応の一部始終を観察することにより、未検出の中間体及び中間生成物を検出しIDO反応機構の解明を目指した。
補助事業期間中、試料調製方法と測定系並びに解析方法を確立し、それらを駆使して、様々な溶液条件で分光測定を行った。IDOは基質濃度が高いときに基質そのものが阻害剤として作用する、基質阻害の性質があり、これまで、酵素に対し基質濃度が高い条件でのみフェリルオキソ種が検出されてきた経緯がある。そこで酵素と基質濃度を等しくし、基質阻害が起きない条件で吸収分光法を用いて反応追跡を行い、グローバルフィッティング解析を行ったところ、フェリルオキソ種は検出されなかった。一方でTrp誘導体を基質として用いた場合に三者複合反応中間体形成速度が速く、また安定化されることを明らかにした。さらにTrpを基質として用いて共鳴ラマン分光法による反応追跡を行ったところ、三者複合体として２つのスペクトル種を検出した。すなわち状態が異なる２つの三者複合反応中間体が存在し、それぞれのO-O伸縮振動バンドの振動数とバンド強度の経時変化から、まず不活性種が形成されその後活性種へと移行して反応が進むことが見出された。これらは反応機構における三者複合体形成とその次のステップへの進行に必要な条件について示唆を与える結果となった。

研究成果

• [雑誌論文] A synthetic model for the possible FeIV2(μ-O)2 core of methane monooxygenase intermediate Q derived from a structurally characterized FeIIIFeIV(μ-O)2 complex. (2022)
  • 著者名/発表者名: Mikata, Y., Aono, Y., Yamamoto, C., Nakayama, H., Matsumoto, A., Kotegawa, F., Harada, M., Katano, H., Kobayashi, Y., Yanagisawa, S., Kubo, M., Kajiwara, A., Kodera, M
  • 雑誌名: Inorganic Chemistry 巻: 61 ページ: 786-790
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.1c02699
  • 査読あり
• [雑誌論文] Revisiting Alkane Hydroxylation with m‐CPBA (mChloroperbenzoic Acid) Catalyzed by Nickel(II) Complexes (2021)
  • 著者名/発表者名: Shinke, T., Itoh, M., Wada, T., Morimoto, Y., Yanagisawa, S., Sugimoto, H., Kubo, M., Itoh S.
  • 雑誌名: Chemistry A European Journal 巻: 27 ページ: 14730-14737
  • DOI: 10.1002/chem.202102532
  • 査読あり
• [雑誌論文] Short-lived intermediate in N2O generation by P450 NO reductase captured by time-resolved IR spectroscopy and XFEL crystallography (2021)
  • 著者名/発表者名: Nomura, T., Kimura, T., Kanematsu, Y., Yamada, D., Yamashita, K., Hirata, K., Ueno, G., Murakami, H., Hisano, T., Yamagiwa, R., Takeda, H., Gopalasingam, C., Kousaka, R., Yanagisawa, S., Shoji, O., Kumasaka, T., Yamamoto, M., Takano, Y., Sugimoto, H., Tosha, T., Kubo, M., Shiro, Y
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 118 ページ: e2101481118
  • DOI: 10.1073/pnas.2101481118
  • 査読あり
• [学会発表] Stopped-flow ラマン・吸収同時測定装置の開発とそれを用 いた IDO 酵素反応追跡の試み (2021)
  • 著者名/発表者名: 河村 味奈、柳澤 幸子、久保 稔
  • 学会等名: 第47回生体分子科学討論会
• [学会発表] ストップトフローラマン・吸収分光計を用いたインドールアミン2,3ジオキシゲナーゼの反応中間体の研究 (2021)
  • 著者名/発表者名: 河村 味奈、名定加峰、柳澤 幸子、久保 稔
  • 学会等名: 第59回日本生物物理学会年会