| 研究課題/領域番号 |
19K05710
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
沓村 憲樹 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 教授 (00439241)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | モルヒナン / チオール基 / 構造活性相関 / マイケルアクセプター / 抗マラリア作用 / δオピオイド受容体拮抗薬 / BNTX / 作用機序解明 |
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| 研究実績の概要 |
当研究室では以前、モルフィナン骨格を有する7-ベンジリデンナルトレキソン（BNTX）およびその誘導体が、薬剤耐性マラリアの耐性を解除する作用や抗トリコモナス活性を有することを見出しており、これらの作用機序の鍵の一つとして、BNTX誘導体の持つ不飽和二重結合が関与しているのではないかと推察した。そこで、「モルフィナン分子構造」と次の三要素、すなわち、「抗マラリア活性」、「チオール付加能（チオールとの反応速度）」、「細胞内活性酸素種の存在濃度」とのそれぞれの相関情報を取得することで、先の仮説を実験的に立証することを目的として本研究を開始した。
まず、BNTXとその誘導体19種を合成した。準備した誘導体のほとんどは、不飽和二重結合の反応性に直接関与するベンジリデン部分を誘導化した化合物であるが、3位フェノール性水酸基をメチルエーテルで保護した化合物や不飽和二重結合を還元して単結合にした還元型BNTXも合成した。そしてこれらの被験化合物の抗マラリア活性を、クロロキン耐性マラリアK1株とクロロキン感受性マラリアFCR3株を用いて評価した。その結果、不飽和二重結合の電子密度が比較的豊富なモルフィナン分子ほど、K1およびFCR3に対する抗マラリア活性が低下する傾向が確認された。
次に、これらの20種の被験化合物それぞれに対し、化学的なチオール捕捉能力の相対評価を行った。グルタチオンやタンパク質のシステイン残基のモデルとしてプロパンチオールを利用し、重DMSO溶媒中での付加速度をNMR実験にて比較した結果、同条件におけるチオール付加能を相対的に数値化することが出来た。
最後に、先の抗マラリア活性の結果と数値化したチオール捕捉能の相関関係を確認した結果、想定していた通り、抗マラリア活性の強いモルフィナン分子ほど、チオール捕捉能も強い傾向にあることを確認・可視化することが出来た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2019年度は、①様々なBNTX誘導体を合成し、②それらのうち、BNTXを含めた20種に対してin vitroにて抗マラリア活性の評価を実施した。抗マラリア活性の評価には、クロロキン耐性マラリアK1株とクロロキン感受性マラリアFCR3株を用い、コントロールとしては2つの既存の薬物（アルテミシニンとクロロキン）を用いた。その結果、既存の薬物ほどではなかったが、全てのBNTX誘導体で中程度の抗マラリア活性が確認された。クロロキン耐性株と感受性株の間で顕著な差異は見られなかったが、分子内の不飽和二重結合の電子密度が比較的豊富なモルフィナン分子ほど、抗マラリア活性は減弱する傾向が観測された。この結果は、不飽和二重結合部位のチオール捕捉能が乏しいほど抗マラリア活性が低下するという、研究当初の仮説を支持するものである。
続いて、そのチオール捕捉能の強度を実験的に数値化して、先の抗マラリア活性との相関を調査することとした。そこで、③抗マラリア活性を評価した先の20種の化合物について、それぞれ重DMSO溶媒中でプロパンチオールを作用させ、経時変化ごとの原料残存率をH-NMR実験で計測した。その結果、化学的に想定通りの結果ではあるが、原料の相対的な残存率、すなわち、各被験化合物のチオール捕捉能を数値化することに成功した。
最後に、この残存率を横軸に、先の抗マラリア活性の評価結果を縦軸にとって相関図を作成したところ、両者の相関を顕著に可視化することができた。すなわち、不飽和二重結合のチオール捕捉能が優れているモルフィナン分子ほど抗マラリア活性が良好であることを示す客観的な分布図を得ることに成功した。
以上の研究成果はMoleculesにて論文報告した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はまず、当初の研究計画で想定していた残りの要素、すなわち、「細胞内活性酸素種の存在濃度」について着目した研究を行う。すなわち、先の20種のモルフィナン分子を細胞内に投与し、投与後の活性酸素種の濃度について相対評価を行う。そして、その結果を先の「抗マラリア活性」や「モルフィナン分子のチオール捕捉能」の結果と比較して、相関情報についての知見を得る。さらに、これらの20種の被験化合物による小規模ライブラリーの構造活性相関情報をもとに新たなモルフィナン誘導体を合成し、最終的に100種以上の中規模ライブラリーへと展開させる。そして、これらの情報をもとにして、最も強力な抗マラリア薬の一つであるアルテミシニンを超えるようなモルフィナン型リード化合物の創製を目指す。
一方では、BNTX誘導体を合成していく過程で、オピオイド受容体への興味深い親和性（受容体タイプ選択性）を示す、2つのリガンドを見出している。基本的に今回抗マラリア活性を評価した全てのBNTX誘導体はδオピオイド受容体に親和性を有しているが、その誘導体はそれぞれ、μオピオイド受容体に選択的に作用する化合物とκオピオイド受容体に選択的に作用する化合物であった。これらについても抗マラリア活性の評価を行い、また、チオール捕捉能や投与後の細胞内活性酸素種存在濃度を検討していくことを考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
抗マラリア活性のin vitro評価を行っている共同研究グループ（北里研究所の熱帯病研究センター）の事情で、2019年度の被験化合物は20検体に留め、当初の予定よりも縮小したことが一つの理由である。
またもう一つの理由は、様々なBNTX誘導体合成の過程で興味深いオピオイド受容体選択性を有する化合物を得たことにある。オピオイド受容体にはμ、δ、κの3つのタイプがあり、BNTXは元々δ受容体に選択的に拮抗作用を有するリガンドとして知られている。今回の被験化合物のほとんどはBNTXのベンジリデン部位を変換した化合物であり、構造的にBNTXと大きな違いは無く、受容体選択性もほとんどがδ受容体選択性であった（一部はμとδが逆転）。しかし今回の誘導体合成の過程で、μ受容体に驚異的な選択性を有する化合物と、κ受容体に驚異的な選択性を有する化合物を偶然見出した。我々は元々、「チオール捕捉能」を抗マラリア活性の一つの鍵と考察し、それを実験的に証明する目的で本研究に着手したが、「δオピオイド受容体拮抗活性」もまた感染性原虫になんらかの影響がある重要な鍵の一つであると考えている。その観点では、これらの偶然見出された新規誘導体もまた抗マラリア活性発現機序を解明する上で重要なリガンドであると考えており、2020年度の研究計画にも含める予定である。
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