| 研究課題/領域番号 |
19K05713
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
花島 慎弥 大阪大学, 理学研究科, 講師 (50373353)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 糖脂質 / FRET / コレステロール / NMR |
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| 研究実績の概要 |
脂質ラフト条件下でのガングリオシドGM3上のシアル酸の傾きの角度、シアル酸とEGF受容体の膜貫通部位直上のLys642間の相互作用、GM3脂質と疎水性ヘリックス間の相互作用の３点を、合成化学を駆使して適切なGM3プローブを得て、固体NMRを用いて生体モデル膜条件下で測定をおこなうことで明らかにする。
今年度は、ガングリオシドGM３の構造解析に先立ち、脂質ラフトのプラットフォームを形成するスフィンゴミエリンの膜界面に存在するコリン頭部の傾きを頭部配座の観点から合成化学と固体NMRを駆使して精密に明らかにした。コレステロールが膜中に存在すると末端の配座が変化してコレステロールを安定化する構造メカニズムを初めて実験的に実証し学術論文にまとめて発表した。これはGM3頭部構造解析の実験手法を検証するものである。また、脂質ラフトを形成するスフィンゴミエリンやGM3のパートナーとなるコレステロールの新規NMRプローブを開発し、新しい脂質ドメイン解析法を合成法とあわせて学術論文に発表した。これによりGM3ドメイン中のコレステロールの含有比率を明らかにすることが可能になった。さらに、シアル酸の傾きが脂質ラフト条件下と非ラフト条件下、モデル膜中でどの程度異なるか調べた。共同研究により供与いただいたシアル酸CF3誘導体を含むGM3を用いて固体NMRを測定することで、ラフト条件下で角度の変化が一部誘起されることを発見し、学術論文を発表した。引き続き頭部構造解析を進めるため、重水素標識したシアル酸を含む３つのGM3プローブのうち一つの合成を達成した。また、EGF受容体の膜貫通ドメインの不溶性ドメイン構造を合成装置を用いて合成した。次年度はGM3蛍光プローブと蛍光標識を施したEGF受容体の膜貫通ドメインとのFRET解析を進める。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究を進めるにあたり３つのシアル酸重水素化プローブが必要となり、これらは化学合成により得る必要がある。このうち、一つの合成を達成しリン脂質膜に導入してコレステロールの存在下、非存在下で重水素固体NMRを測定した。その結果、二つの条件下でスペクトルの分裂幅に有意な違いを観測した。さらに、岐阜大学安藤弘宗教授との共同研究により、シアル酸CF3体を有する本研究の目的にかなうGM3プローブの一つを供与いただいた。このプローブを用いて、リン脂質とコレステロールの存在下でリポソーム膜を作成してフッ素固体NMRを測定した。３つのフッ素原子の同種核双極子相互作用による三重線からなるスペクトルを得て、コレステロール非含有膜条件下での測定結果と比較した。その結果、明確な分裂幅の違いが観測され、膜中でのコレステロールの有無がGM3のシアル酸の傾き角や揺らぎを制御している可能性を示唆した。スフィンゴミエリンやコレステロールといった脂質ラフト構成に不可欠な脂質に関しても同様に研究を進め、膜上での配向や脂質分配を明らかにした。
GM3が相互作用するタンパク質EGFRの膜貫通部位と膜近傍の領域を含む30残基程度の配列の合成を達成した。Fmoc固相合成法により30残基を超える疎水性領域ペプチドを合成してN末端に安定な蛍光部位としてNBDを導入した。このペプチドの脱保護、精製をおこなったが強い疎水性相互作用による凝集が問題になった。種々の条件を検討した結果、イソプロパノールとギ酸を含む溶媒をHPLCの移動相に用いることで高純度で目的のNBD標識を有する膜貫通ペプチドを単量体として精製できた。このペプチドを脂質膜に導入して、岐阜大学の安藤弘宗教授らのグループから供与いただいたGM3の膜物性を再現できる優れた蛍光プローブとの脂質膜上での側方FRET観測を試み、予備的な検討の結果、FRETシグナルを観測できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
蛍光プローブを用いたGM３－EGF受容体膜ドメインの脂質膜上での相互作用の解析をFRETを用いておこなう。化学合成した蛍光標識化EGF受容体膜ドメインの多量化に伴う自己消光がGM3存在下で解消することを見出し、GM3が単量体を安定化する可能性が高いことを示す実験結果を得ており、これを検証する。さらに、優れたGM3蛍光プローブを用いて、GM3－EGF受容体間の動的な相互作用をFRET寿命測定を用いて解析する。脂質膜上での側方FRET観測では、溶液中と異なり、蛍光プローブが膜上に濃縮されて存在するため、種々のアーティファクトが存在する。蛍光寿命を用いることで定常状態でのFRETと比べアーティファクトが低減した純粋なFRET成分を抽出して観測することが可能である。
GM3配向解析に関しては現在、残る二つのプローブに関しても合成を進めている。この二つも今年度中に合成を達成して、固体NMR測定を実施する。さらにフッ素化プローブとリン核や炭素核間の異種核双極子相互作用をREDORを用いて測定することでシアル酸残基と膜表面との距離測定を試みる。さらに、本研究により確立されてきた手法を使ってコレステリルグルコシドやラクトシルセラミドといった他の糖脂質に研究を展開して、その膜中での配向や脂質間相互作用を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度に実施した測定において、1月から3月分の測定料が次年度に請求されるため。また、年度末のコロナウイルスの蔓延により、実験の実施が一時的に滞っているため。
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