| 研究課題/領域番号 |
19K05716
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| 研究機関 | 秋田県立大学 |
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研究代表者 |
志村 洋一郎 秋田県立大学, 生物資源科学部, 准教授 (60332920)
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| 研究分担者 |
上松 仁 秋田工業高等専門学校, その他部局等, 嘱託教授 (20435407)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 抗カビ物質 / バチルス / トリコデルマ |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題は申請者らが見出した糸状菌株（カビ）とそれに拮抗する細菌株（バチルス）をモデル系として、（１）細菌の抗カビ活性およびカビ菌糸・胞子形成促進活性の主体の解明、（２）カビ菌糸・胞子形成における抗カビ物質の作用点の解明、そして（３）抗カビ物質のカビ菌糸・胞子形成への影響を明らかにし、異種微生物間の相互作用や形態変化など生存戦略に与える分子メカニズムの解明を目指している。
２０２０年度は、以下の項目について研究を進めた。
①抗カビ物質の精製および構造解析：２０１９年度に複数の抗カビ物質の含有が明らかとなったため、2020年度も引続き抗カビ物質の精製と構造解析を最重要課題とした。バチルス分離株の培養液酸沈殿抽出物をODSカラムを用いた分取HPLCに供し、３つの抗カビ物質画分（９、１０、１１）を得た。MS解析により、画分９からは分子量１０３５、画分１０からは分子量１００７と１０３５、画分１１からは分子量１０２１と１０３５が検出され、画分９が高度に精製された。画分９を簡易迅速アミノ酸分析に供し、得られたアミノ酸組成から新規物質の可能性が示唆された。
②抗カビ物質の温度耐性：バチルス分離株の抗カビ物質の熱耐性を知る知るために、培養液の酸沈殿抽出物について、１２１℃、１５分間の加熱処理後、バイオアッセイに供した。加熱後も抗カビ活性が確認されたことから、抗カビ物質の耐熱性が確認された。
③カビ標準株に対する抗カビ物質の作用：カビ分離株の性質が変化している様子が観察された。そのため、同種（トリコデルマ・リーセイ）の標準株でバチルス分離株の抗カビ活性測定を検討し、カビ分離株と同様に生育阻害効果を計ることが可能であることが確認された。今後、抗カビ物質に対するカビの細胞応答解明に関し、ゲノム配列が既知であるカビ標準株の使用が可能であることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究は、申請者らが見出したカビ分離株とそれに拮抗するバチルス分離株をモデル系とし、①抗カビ活性およびカビ菌糸・胞子形成活性の主体の解明（I.分離・精製；II.生産条件の検討；III.生合成経路の解明）、②カビ菌糸・胞子形成における抗カビ物質の作用点の解析（IV.カビ転写物解析；V.カビ代謝物解析）、そして③抗菌・抗カビ活性の応用（VI.抗菌スペクトルの測定；VII.抗菌・抗カビ物質の分離・同定）を検討し、異種微生物間の相互作用解明を目指している。
２０２０年度は、I、III、IV、およびVの検討を予定していた。Iについて、精製方法は確立しているものの構造解析に必要な量を得るまでに予想以上に時間がかかってしまい、III、IV 、および V に取りかかることができず、やや遅れているとの判断をした。
しかしながら、抗カビ物質精製において３つの画分（９、１０、１１）が得られ、MS解析により画分９は高度に精製されていることが確認できたため、簡易迅速アミノ酸分析に供した。その結果、得られたアミノ酸組成は、バチルス属菌株の産生する既知抗菌リポペプチドのbacillopeptin、iturin、およびPlipastatin などとは異なっていることが明らかとなり、さらなる構造解析の必要性が確認された。画分１０と１１は、今後さらに精製をすすめ、画分９と同様に構造解析を進めていく。抗カビ物質の分離精製を進めアミノ酸分析（組成、配列、DL解析）やNMR測定などでその構造を決定することは、天然における異種微生物間の生存戦略の解明に繋がると共に応用を進める上でも重要となる。そのため、今後も抗カビ物質の構造決定を最優先課題として取り組んでいく。
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| 今後の研究の推進方策 |
２０２０年度は、抗カビ物質の精製を中心に研究を進め、分取HPLCにて３つの活性画分（９、１０、１１）を得た。特に、画分９は高度に精製されたことから簡易迅速アミノ酸分析に供した。そのアミノ酸組成からバチルス属菌の産生する既知抗菌リポペプチドとは異なる新規物質の可能性が示唆された。そのため、今後さらに詳細な情報を得るために構成アミノ酸のDL解析を始め、LC-MS/MS解析による配列解析を実施する。並行して、各種NMRを測定し構造解析を進める。その他２画分についても精製を進め、同様の解析を進める。
本研究は、細菌の抗カビ物質カビ側の細胞応答（転写物解析および代謝物解析）を明らかにし異種微生物間の相互作用の解明を目指しているが、バチルス分離株の産生する抗カビ物質に新規構造のある可能性が示唆されたことから、２０２１年度も引続き抗カビ物質の分離・精製と構造決定を最優先課題として進め、次にその生合成経路やカビの細胞応答を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
２０２０年度は、抗カビ物質の精製と同定を最優先課題として研究を進めた。抗カビ物質の精製は分取HPLCにて行ない、予想以上に時間がかかったが３つの活性画分（９、１０、１１）を得た。その中の画分９についてMS解析にて高度に精製できていることが確認されたため、簡易迅速アミノ酸解析に供した。その結果、既知物質とは異なるアミノ酸組成をもつことが明らかとなった。そのため、画分９を構成するアミノ酸構造の詳細を知るためにアミノ酸のDL構造に関し依頼分析したのだが、年度内に結果を得るには至らなかった。そのため次年度使用額が生じた。新年度早々には結果が出るため、これに当てる予定である。今後、これらアミノ酸がどのように配列しているのかを知るためにLC-MS/MS解析による配列解析に予算を使用する予定である。残った２画分についても、同様に精製を進め迅速アミノ酸分析に供する予定である。
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| 備考 |
（１）志村洋一郎、上松仁、髙橋茉佑、加藤蒼、佐藤有里華、松浦成美、稲元民夫．秋田県立大学ウェブジャーナルA、第8号：62－68.（2020-09-30）．
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