効率的な2本鎖DNA認識を達成するペプチド核酸の開発

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K05730
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 愛場 雄一郎 名古屋大学, 理学研究科, 助教 (10581085)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: DNA / PNA / ペプチド核酸 / インベージョン / 核酸 / 遺伝子

研究実績の概要

2本鎖DNAの配列選択的認識は基盤的な技術であるがゆえ、応用可能性は非常に高く、ゲノム編集、遺伝子発現制御などの幅広い展開が可能である。それに対しこれまでは、Zinc Finger、TALE、Cas9などのDNA結合タンパクを利用して、主に研究が進められてきた。もし合成分子で2本鎖DNAを配列選択的に認識することが出来れば、実験手技の大幅な簡便化だけでなく、従来のDNA結合タンパクにはない新たな研究展開が期待される。そこで本研究では、人工核酸であるペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid, PNA）の特徴的な2本鎖DNA認識様式であるインベージョンに着目し、新たなDNA認識技術の構築を目指した。これまでのインベージョンでは、PNAの核酸塩基部への複雑な化学修飾が効率的なDNA認識効に必須であった。しかし、その合成は煩雑であり、このPNAの合成面が、インベージョン応用研究の汎用化への足かせとなっていた。
本研究では、必要となる核酸塩基への化学修飾を簡素化することで、より簡便なPNA合成を達成し、様々な応用研究に適応しやすいインベージョン系の構築を目指した。今年度は、市販のPNAモノマーであるFmoc-G PNAモノマーを利用し、1ステップの非常に簡便な化学修飾を用いることで、PNAのインベージョンの促進を検討した。具体的には、正電荷を核酸塩基中に導入することで、PNAのDNA結合力の向上および、PNA間の相互作用の抑制を同時に達成し、より高効率なインベージョン系の構築に成功した。PNAのインベージョン効率はマイクロチップ電気泳動により評価を行い、PNAによるDNAおよびPNA認識については、UVによる融解温度測定により融解温度Tmを算出し、設計通りに正電荷導入PNAが機能していることを確認した。さらに、従来のPNAでは効率的なインベージョンが困難であった生理的条件下でも高いインベージョン効率を示すことを明らかにした。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本研究課題「効率的な2本鎖DNA認識を達成するペプチド核酸の開発」に向けて、申請書には大別して3つの研究テーマの検討について記載した。そのうちの1つ目が、塩基部位への正電荷導入を用いた新規インベージョン系の開発である。本テーマに関しては、前述のように検討を終え、学術論文として発表を行った（M. Hibino, Y. Aiba*, and O. Shoji*. “Cationic guanine: positively charged nucleobase with improved DNA affinity inhibits self-duplex formation”, Chem. Commun., 56(17), 2546-2549 (2020).）また、査読の際にその研究成果を評価され、inside back coverとして採択された。現在は正電荷導入PNAのさらなる応用研究について、共同研究も含めながら展開を進めている。さらに、現在は申請書に記載した残りの2つのテーマを前倒して検討を進めており、当初の計画以上の進展であると判断した。

今後の研究の推進方策

申請書には、前述の「効率的な2本鎖DNA認識を達成するペプチド核酸の開発」に加えて、「化学修飾に依存しない新しい配列設計を用いたインベージョン系を構築」を行うことで、インベージョンの手技の簡便化とその認識効率の向上を図ることを記載している。さらに、「従来明らかでなかったPNAのインベージョン複合体の構造解析」を行うことで、詳細な構造情報に基づき、PNAをはじめとした次世代の人工核酸に対する合理的な設計指針の構築を目指す点も重要な研究課題として挙げている。今後の研究期間内には、上記2点について重点的に検討を進め、PNA（特にPNAによるインベージョン）を汎用的な2本鎖DNA認識技術として完成させることを目指したい。また、本研究課題の研究期間全体で得られた技術を統合し、様々な生命現象の解明を目指した応用展開につなげたいと考えている。

研究成果

• [雑誌論文] Cationic guanine: positively charged nucleobase with improved DNA affinity inhibits self-duplex formation (2020)
  • 著者名/発表者名: Hibino, Masaki, Aiba, Yuichiro, Shoji, Osami
  • 雑誌名: Chemical Communications 巻: 56 ページ: 2546-2549
  • DOI: 10.1039/D0CC00169D
  • 査読あり
• [学会発表] Sequence-selective recognition of double-stranded DNA (2020)
  • 著者名/発表者名: M. Shibata, M. Hibino, Y. Aiba, O. Shoji
  • 学会等名: The 3rd IRCCS - The 2nd Reaction Infography Joint International Symposium: “Reaction Imaging Meets Materials Science”
  • 国際学会
• [学会発表] ペプチド核酸・PNAによる２本鎖DNA認識 (2020)
  • 著者名/発表者名: 愛場雄一郎
  • 学会等名: 核酸化学懇話会 2020 北海道・東地区セミナー（次世代の核酸化学を考える）
• [学会発表] Chemically-modified peptide nucleic acids for their in cellulo applications (2019)
  • 著者名/発表者名: M. Shibata, Y. Aiba, M. Hibino, G. Urbina, Osami Shoji
  • 学会等名: ASUKA Symposium 2019 A New Phase of Regenerative Medicine
  • 国際学会
• [学会発表] ペプチド核酸を用いた二本鎖DNAの配列選択的認識法の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 柴田将成、日比野柾、愛場雄一郎、荘司長三
  • 学会等名: 第32回生物無機化学夏季セミナー
• [学会発表] 人工核酸PNAを用いた新規二本鎖DNA認識法の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 柴田将成、日比野柾、愛場雄一郎、荘司長三
  • 学会等名: 第9回CSJ化学フェスタ2019
• [学会発表] 未修飾PNAによる二本鎖DNAの配列選択的認識 (2019)
  • 著者名/発表者名: 柴田将成、日比野柾、愛場雄一郎、荘司長三
  • 学会等名: 核酸化学 若手フォーラム2019
• [学会発表] Sequence-selective Recognition of dsDNA by unmodified PNA (2019)
  • 著者名/発表者名: M. Shibata, M. Hibino, Y. Aiba, O. Shoji
  • 学会等名: The 46th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry (ISNAC 2019)
  • 国際学会
• [学会発表] 人工核酸PNAを用いた新規二本鎖DNA認識法の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 柴田将成、日比野柾、愛場雄一郎、荘司長三
  • 学会等名: 統合物質創製化学研究推進機構国内シンポジウム
• [学会発表] 人工核酸PNAとペプチド・タンパク質との複合化によるDNA認識効率の向上 (2019)
  • 著者名/発表者名: 河内奈緒美、日比野柾、愛場雄一郎、荘司長三
  • 学会等名: 第50回 中部化学関係学協会支部連合秋季大会
• [学会発表] Inhibition of Intra- and Intermolecular Interaction between Peptide Nucleic Acids (2019)
  • 著者名/発表者名: M. Hibino, Y. Aiba, O. Shoji
  • 学会等名: NU-UoE JD and JSPS Core-to-Core Joint-Workshop on "New Horizons in Chemistry and Materials Science"
  • 国際学会
• [学会発表] Inhibition of Self-duplex Formation by Using Methyl-adducted PNA (2019)
  • 著者名/発表者名: M. Hibino, Y. Aiba, O. Shoji
  • 学会等名: Commemorative International Symposium of the Japan Society of Nucleic Acids Chemistry
  • 国際学会
• [学会発表] Sequence Specific DNA Damage Induced by Metal-Complex-PNA Conjugate (2019)
  • 著者名/発表者名: M. Hibino, Y. Aiba, Y. Watanabe, O. Shoji
  • 学会等名: 19th International Conference on Biological Inorganic Chemistry (ICBIC-19)
  • 国際学会
• [学会発表] 金属錯体配位ペプチド-PNA複合体による配列特異的DNA切断 (2019)
  • 著者名/発表者名: 日比野 柾
  • 学会等名: 核酸化学 若手フォーラム2019
• [学会発表] PNA with Metal-Coordinating Peptide for Sequence-Specific DNA Cleavage (2019)
  • 著者名/発表者名: M. Hibino, Y. Aiba, O. Shoji
  • 学会等名: The 46th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry (ISNAC 2019)
  • 国際学会
• [学会発表] 生理的条件下で機能する化学修飾ペプチド核酸（PNA）の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 愛場雄一郎、日比野柾、河内奈緒美、柴田将成、荘司長三
  • 学会等名: 日本ケミカルバイオロジー学会 第14回年会
• [学会発表] Peptide Chemistry (2019)
  • 著者名/発表者名: Y. Aiba
  • 学会等名: ASUKA Symposium 2019 A New Phase of Regenerative Medicine
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Effective Sequence-selective Recognition of Double-stranded DNA via Invasion Complex Formation by Peptide Nucleic Acids (2019)
  • 著者名/発表者名: Y. Aiba, M. Shibata, M. Hibino, O. Shoji
  • 学会等名: Commemorative International Symposium of the Japan Society of Nucleic Acids Chemistry (CISNAC2019)
  • 国際学会
• [学会発表] 汎用的なDNA認識法に向けた新規PNAインベージョンの開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 愛場雄一郎、柴田将成、日比野 柾、荘司 長三
  • 学会等名: 第13回バイオ関連化学シンポジウム
• [学会発表] 化学の力で生物の機能を制御する-人工核酸を利用したDNA認識- (2019)
  • 著者名/発表者名: 愛場雄一郎
  • 学会等名: 岡崎北高校大学講座
  • 招待講演
• [学会発表] Double-duplex invasion complex formed by unmodified PNA for the recognition of double-stranded DNA (2019)
  • 著者名/発表者名: Y. Aiba, M. Shibata, M. Hibino, O. Shoji
  • 学会等名: The 46th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry (ISNAC 2019)
  • 国際学会
• [備考] ペプチド核酸(PNA)による遺伝子制御
  • URL: http://bioinorg.chem.nagoya-u.ac.jp/research/pna.html
• [備考] 研究業績
  • URL: http://bioinorg.chem.nagoya-u.ac.jp/publications/paper.html
• [産業財産権] インベージョン複合体の形成方法 (2019)
  • 発明者名: 愛場 雄一郎、荘司 長三
  • 権利者名: 国立大学法人名古屋大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2019-132460