| 研究課題/領域番号 |
19K05734
|
|---|
| 研究機関 | 大阪大学 |
|---|
研究代表者 |
大崎 恵理子 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (50447801)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | ポリメラーゼ / 非核酸系RT阻害剤阻害剤 / ドッキングシミュレーション |
|---|
| 研究実績の概要 |
ウイルス感染症克服において，ウイルスゲノムの複製に不可欠なポリメラーゼを標的とした阻害剤の開発は最重要課題の一つである。重篤な肺炎症状を引きおこすSARS-CoV-2の世界的な感染拡大による危機に際して，治療薬候補としていち早く効果が認められたファビピラビルやレムデシビルなどは，いずれもポリメラーゼを標的とした核酸アナログ製剤である。これらのことからも示唆されるように，感染者からのウイルス排除という目的においてポリメラーゼを標的とした阻害剤は強力な治療薬となりうる。
申請者らはこれまでにB型肝炎ウイルス（HBV)のポリメラーゼの活性に重要な逆転写酵素（RT)ドメインの高純度精製タンパク質を用いたin vitroアッセイ系を構築し，この系を用いて有望な候補阻害剤をスクリーニングにより見出した。これらの候補阻害剤についてHBV RTの結合部位を予測し新たな知見を得ることは，RTの活性に重要なドメインの解明やポリメラーゼの作用機序解明に有益な情報をもたらすものと考えられる。そこで，本研究ではドッキングシミュレーションによる候補阻害剤の結合部位予測とin vitroアッセイ系での実測データ双方向からのアプローチにより，阻害剤の作用機序の解明を目指す。さらには多剤併用による相乗効果を最大限引き出すために，結合部位の異なる複数の候補薬剤の組み合わせをシミュレーションにより検証し，in vitroアッセイ系でこれを検証，評価する。本研究により，ポリメラーゼ作用機序に基づく新規治療薬の開発における新たな知見が得られることが期待される。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
我々が用いている精製RTは，ポリメラーゼのテンプレート・プライマー・基質結合活性は示すものの，DNA合成における伸長活性を持たないか，極めて低いことがわかっている。しかしながら，このアッセイ系で同定したヒット化合物のいくつかは，モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)のRTの活性を阻害することが明らかとなった。MMLV RTは市販されているRTであり伸長活性を保持しているが，HBV RTの候補阻害剤によりその活性が阻害される。一方でHBV ポリメラーゼはその発現・精製が非常に困難であるため，これまで結晶構造が得られていない。そこで，MMLV RTのPDBデータを元に，MMLV RTの活性を阻害した化合物についてドッキングシミュレーションを試みた。興味深いことに，いくつかの阻害化合物の結合部位は非常によく似ており，結合に関与するアミノ酸に類似性が見られた。一方，コントロールとして阻害活性を持たない低分子化合物を用いてシミュレーションしたところ，自由結合エネルギーの値は親和性が低いものであったことから，シミュレーションの結果は妥当なものであると考えられた。また，HIV RTのアミノ酸置換によりエンテカビル結合能を持つ，HBV RTの性質により近い変異体（HBV RT mimic) の結晶構造が明らかになっている。このHBV RT mimicのPDBデータを用いてドッキングシミュレーションを行ったところ，候補化合物のいくつかは非常によく似た領域に結合することが推測された。
|
| 今後の研究の推進方策 |
シミュレーションによる候補阻害剤の結合部位予測において，これまでに試行した化合物はいずれも非常によく似た部位に結合する結果を得ている。当初は複数の結合ポケットを阻害しうる化合物の併用による相乗的阻害効果を検討することを想定していたものの，実際には阻害効果と結合部位が想定以上にリンクしていることが示唆された。そこで，今後は阻害活性が弱い化合物についてもシミュレーションを試行し，異なる結合部位を持つ化合物を探索することを視野に入れたい。また，異なるアルゴリズムで動作するシミュレーションソフトを複数用いることにより，それぞれの違いや精度，共通性などを適切に評価し，in vitroアッセイ系での評価と合わせて整合性を確認する必要がある。また，ドッキングシミュレーションに基づく候補阻害剤のRT結合予測部位をアミノ酸置換により変異させた変異型RTを作製し，in vitro アッセイ系による活性への影響，および候補阻害剤投与時の活性への影響を検討し，予測値と実測値の整合性を評価する。さらに活性に影響を与えうる部位を同定し，その領域に絞ったドッキングシミュレーションによる化合物スクリーニングを行う。ドッキングシミュレーションによって得られた候補化合物の阻害効果を，in vitroアッセイ系で評価する。また，有望な阻害剤が見いだされた場合，セルベースアッセイや動物モデルでの薬剤評価を行う。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当初購入予定であったタンパク質立体構造解析ソフトについては，アカデミックフリーソフトの使用で代用しており，2019年度での購入は保留とした。次年度はシミュレーションに基づいて変異体作製や活性測定などの消耗品や，必要に応じて有償ソフトの購入に充当する予定である。
|
