| 研究課題/領域番号 |
19K05738
|
|---|
| 研究機関 | 神奈川工科大学 |
|---|
研究代表者 |
飯田 泰広 神奈川工科大学, 応用バイオ科学部, 教授 (40329305)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | 抗真菌 / 先端成長 / C. albicans / ガラクトシダーゼ / S. cerevisiae |
|---|
| 研究実績の概要 |
深在性真菌症は罹患すると重篤化し死亡率が高いため問題となっているが、上市されている抗真菌剤は4種9剤と少なく、新たな薬剤が望まれている。しかし、真菌がヒトと同じ真核生物であるため、選択毒性を得ることが難しく、開発が進んでいないことが現状である。本研究では、真菌が先端成長を行うという特徴に着目し、これを阻害する生理活性物質は成長を抑制し、新たな選択毒性を有する抗真菌薬のシード化合物になると考えている。すでに先端成長に必須なタンパク質の局在を蛍光により可視化することに成功しており、本研究では、それを利用して当該タンパク質の輸送に関わる因子を可視的に評価するスクリーニング系を構築し、先端成長に必須な輸送因子を解明することを目的としている。このような因子を見出すことができれば、それをターゲットとした阻害剤スクリーニングを行うことにより、選択毒性の高い新規抗真菌薬のリード化合物の取得が期待できると考えている。
本年度は、昨年度構築できなかったC. albicansにおいて先端輸送を評価するためのベクター系の構築に取り組んだ。菌株にC. albicans CAI4を選定し、ベクターにpRC2312を用いた。このベクターに、先端輸送されることがわかっているBgl2（グルカナーゼ）にGFP（緑色蛍光タンパク質）を融合させた配列を導入し、エレクトロポレーション法で形質転換を行った。またBgl2に関しては、通常の活性型と、触媒部位にアミノ酸置換を入れて活性を失わせたものを用いた。
Lacプロモーターを用いた系では発現が観察できなかったため、ガラクトース誘導型のプロモーターに変更した結果、蛍光を観察することができた。しかし、本来の発現量を考慮し、ゲノム編集技術によりC. albicansのゲノムのBgl2配列の下流にGFPを挿入しその傾向を評価した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
2019年度の予定は、C. albicansを用いた先端輸送評価系の開発であった。ここで、これまで当研究室で先端成長評価を行ってきた出芽酵母のS. cerevisiaeから糸状菌を形成できるC.albicansに移行することが目的であった。また、2020年度の予定は、2019年度に構築した系を用いて先端輸送因子（小胞輸送に関わるタンパク質のうち、先端輸送に関する因子）のスクリーニングを行う予定であった。
2019年度修了の時点で、ベクターを構築できたが、先端への輸送を観察することができず、やや遅れている判定としていた。そのため、2020年度はベクター系の構築をした後、先端輸送の評価を行い、その先端輸送を指標にsiRNAを用いて先端輸送因子を探索する予定であった。しかし、蛍光を観察することができたが、酵母における出芽部への局在のように、C.albicansにおいて菌糸型にした際の先端部への蛍光の局在を評価できていないのが現状である。発現量が多いためか、液胞部に多く観察されているため、ゲノム編集によりC.albicansのゲノムにあるBgl2の下流にGFPを挿入するためのベクター系を構築、実際にC.albicansへの編集を試みている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本年度は最終年度になるため、C.albicansを用いた先端輸送評価系を完成させ、その局在を指標にした先端への輸送因子の評価を来なう(siRNAを用いて発現抑制による先端輸送に影響を与える因子の探索を行う）。また、輸送に影響を与えた因子に関しては同様にsiRNAを用いて、ヒトの培養細胞を対象に毒性評価（生育の影響評価）を行い、毒性を有しない因子を新たな抗真菌剤のターゲットとして選定したいと考えている。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
ほぼ予定通り使用したが、緊急事態宣言等の影響もあり、少し残額が生じることとなったが、無理に使用はせずに次年度使用することとした。2020年度購入予定であったものを含め、2021年度予算と合わせて使用する予定である。
|
