| 研究課題/領域番号 |
19K05761
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| 研究機関 | 茨城大学 |
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研究代表者 |
長南 茂 茨城大学, 農学部, 教授 (70312775)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | コエンザイムA / アセチル-CoA / マロニル-CoA / ポリヒドロキシ酪酸 / 脂肪酸 / パントテン酸キナーゼ / アセチル-CoAカルボキシラーゼ / 大腸菌 |
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| 研究実績の概要 |
本申請では、様々な代謝経路でアシル基の供給源として利用されるアセチル-CoAおよびマロニル-CoAを増産させ、有用物質生産におけるCoAコファクターエンジニアリングの有効性を示すことを目的とする。2020年度も引き続き①アセチル-CoA増産がポリヒドロキシ酪酸（PHB）生産に及ぼす影響、②マロニル-CoA増産が脂肪酸増産に及ばす影響について試験した。①では、アセチル-CoA増産用プラスミドとPHB合成酵素発現用プラスミドを持つ大腸菌の形質転換体を最少培地で培養後、蓄積したPHBをガスクロマトグラフィーで解析した。2019年度に、30℃培養の結果から、CoaAによるアセチル-CoA生成系の強化がPHB増産に貢献することを明らかにした。2020年度は外来のCoaA遺伝子導入によりPHB生産が促進されるのを再確認すると共に、CoA生合成経路の出発物質であるパントテン酸の添加でPHB生産量が1.8倍に増加するのを明らかにした。また、30℃培養に比べると、37℃培養ではPHB生産量は高く、CoaA発現下でパントテン酸無添加条件下で培養した菌体が最も多くのPHB（23%(w/w)）を生産した。②では、2019年度にマロニル-CoA増産用プラスミドとオレイン酸を生合成できる脂肪酸増産用プラスミドを組み合わせた形質転換体で1 g/Lを超える脂肪酸を生産することを明らかにした。2020年度は細胞内CoAプールを解析し、CoAプールのサイズを大きくしなくてもアセチル-CoAおよびマロニル-CoAの供給系を強化すれば、脂肪酸増産は十分に可能であることを示した。遺伝子破壊株による脂肪酸生産の解析では、マロニル-CoA増産用プラスミドを持つ脂肪酸合成抑制因子（FabR）の遺伝子破壊株で脂肪酸合成が促進された。しかしながら、FabRの遺伝子破壊だけでは脂肪酸増産は起こらないことが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
アセチル-CoAを基質とするPHB生合成およびマロニル-CoAを基質とする脂肪酸生合成では、それぞれのCoA誘導体の供給系を強化すると物質生産が促進されることが昨年度に続き確認され、CoAコファクターエンジニアリングの物質生産に対する有効性が示された。しかし、高度不飽和脂肪酸生産での有効性確認試験においては、EPAおよびDHA生産用プラスミドの構築に2年かかり、やっとEPAおよびDHAの生産試験が開始できる状態になった。2021年度はマロニル-CoA生成系を強化した大腸菌でのEPAおよびDHA生産試験に注力し、並行してアセチル-CoA分解系酵素の単一遺伝子破壊株を宿主にしたPHB生産を実施する予定である。
前記したように本申請の大きな目標は達成され、研究全体としてはおおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
マロニル-CoA供給系の強化と脂肪酸生産の関係が最も進展している領域であり、パントテン酸の存在下および非存在下、また培養温度の16～37℃まで広く試験結果が得られている。2021年度はこの知見をEPAおよびDHA生産に利用し、大腸菌での高度不飽和脂肪酸生産の可能性、確立された要素技術が低温でも機能するかなど応用研究を中心に展開する。
アセチル-CoA供給系の強化のPHB生産への有効性も明らかになっている。アセチル-CoAに関しては、アセチル-CoA分解系酵素の単一遺伝子破壊株を使って、細胞内のアセチル-CoA供給効率をさらに良くし、この効果がPHB生産に結び付くかどうかを試験する。
これらの結果を合わせれば、脂肪酸、あるいはPHBの高生産条件下でアセチル-CoAおよびマロニル-CoA供給の重要性が実験的に明らかにされ、本要素技術の物質生産に対する有用性が証明される。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2020年度は6月開催予定であったアメリカ微生物学会（シカゴ）での研究成果報告が新型コロナウイルス感染拡大のためキャンセルされた。この外国旅費分が次年度に繰り越しとなった。
2021年度は繰り越された額を試薬などの消耗品費に充てて使用する。
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