| 研究課題/領域番号 |
19K05765
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| 研究機関 | 長岡技術科学大学 |
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研究代表者 |
高橋 祥司 長岡技術科学大学, 工学研究科, 教授 (90324011)
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| 研究分担者 |
柴田 公彦 長岡技術科学大学, 工学研究科, 准教授 (10369928)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | D-アスパラギン酸 / 乳酸菌 / アスパラギン酸ラセマーゼ / Lactobacillus sp. / 高生産機構 |
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| 研究実績の概要 |
近年，D-アスパラギン酸（D-Asp）の美容効果，生殖機能の改善・維持効果や統合失調症の改善効果なの改善効果などが報告されたことから，D-Aspの多様な応用的利用が期待されている．健康上有益な乳酸菌は，細胞壁構成成分としてD-Aspを利用し，細胞外にD-Aspを分泌生産することが知られている．申請者らは，D-Aspに対して高い特異性を示す酵母Cryptococcus humicola UJ1株由来のD-アスパラギン酸オキシダーゼ（ChDDO）を見いだし，ChDDOを用いたD-Asp定量法を開発してきた．そこで本研究では，ChDDOを用いたハイスループットなD-Asp高分泌生産乳酸菌のスクリーニング法を開発してD-Asp高分泌生産乳酸菌を単離し，そのD-Asp高分泌生産機構を明らかにすることで，新規な機能性食品の開発や，医農薬品原料として有用で機能性を有するD-Aspの高発酵生産法を開発するための基盤を築くことを目的とした．
本年度は，昨年度単離したD-Asp高生産乳酸菌Lactobacillus curvatus WDN19株のD-Asp高生産機構に関する以下の知見を得た．WDN19株によるD-Asp生産は，主に培養液に含まれるL-Aspのアスパラギン酸ラセマーゼ（RacD）によるラセミ化によること，またD-Asp高生産能は細胞内の高いAspR活性によることが分かった．また，このWDN19株の高いRacD活性はracD遺伝子の高発現に起因すると考えられた．加えて，WDN19株はD-Aspの前駆体であるL-Aspの生合成能も高く，L-Aspの生合成にアスパラギンデアミナーゼが関与すると考えられた．さらに，WDN19株によるD-Asp高生産は培養液pHが重要であり，pHを中性領域で安定化させることで約5倍高いD-Asp生産が可能となった．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在までに，ChDDOを用いたハイスループットなD-Asp高分泌生産乳酸菌のスクリーニング法を開発し，種々の発酵食品から単離した乳酸菌から，既知のD-Asp高生産乳酸菌の約5~7倍近いD-Asp生産を示すLactobacillus curvatus WDN19株を単離することに成功した．また，WDN19株のD-Asp生産がRacDにより行われており，WDN19株の高いD-Asp生産能は細胞内の高いRacD活性に起因することを明らかにした．さらに，WDN19株によるD-Asp高生産には培養液のpHが重要であり，pHを中性領域に安定化させることで生産能が約5倍増加させることに成功した．さらに，WDN19株の全ゲノム配列を明らかにしてracDホモログ遺伝子を取得し，大腸菌による発現により機能的なRacDをコードしていることを明らかにした．以上の研究の進捗状況から，おおむね順調に進展していると判断した．
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究は順調に進展していることから，今後はWDN19株におけるracD遺伝子の高発現機構やD-Asp分泌機構に関する知見を得ることを目的として，以下の項目について検討する予定である．
（１）racD遺伝子の高発現機構の解析：WDN19株とD-Asp生産能が低いLb. curvatusの基準株（NBRC 15884株）におけるracD遺伝子の転写レベルをreal-time PCRにより解析し，WDN19株の高いRacD活性がracD遺伝子の高い転写レベルによるかどうか明らかにする．また，各々の株からracD遺伝子のプロモーター領域を取得してその下流にルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子を挿入したプロモーターアッセイ系を構築して，プロモーターの転写活性能を評価する．さらに，WDN19株のプロモーター配列の変異解析により，高転写能に寄与する塩基配列を明らかにする．
（２）D-Asp分泌機構の解析：いくつかの細菌において酸性L-アミノ酸の細胞外分泌が機械受容体チャネル（MscS）により行われることが報告されている．我々はWDN19株のゲノム配列にMscSホモログ遺伝子を見いだしている．そこで，MscSとD-Asp分泌生産との関係を明らかにするため，WDN19株のMscS遺伝子破壊株を作成し，D-Asp分泌生産に及ぼす影響を解析する．
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