2019 年度実施状況報告書

Geobacter属細菌の電極への電子伝達に関する構造生物学的解析

研究課題

研究課題/領域番号	19K05771
研究機関	宮崎大学
研究代表者	井上謙吾宮崎大学, 農学部, 准教授 (70581304)
研究分担者	和田啓宮崎大学, 医学部, 准教授 (80379304)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード	シトクロムc / 微生物燃料電池 / Geobacter / X線結晶構造解析
研究実績の概要	鉄還元菌Geobacter sulfurreducensは細胞外への電子伝達能力が極めて高く、電極への電子伝達メカニズムの解明は微生物燃料電池への応用において重要な研究課題である。本研究では本株が電極への電子伝達に必須な細胞外膜シトクロムOmcZの３次元構造を明らかにし、微生物が電極へ直接電子伝達を行う能力についてそのメカニズムを明らかにすることを目的としている。OmcZは、水溶性の高い50 kDaのシトクロムOmcZLとして生産された後、ペリプラズム、あるいは細胞外（未解明）でプロテアーゼによる切断を受けて30 kDaの水溶性の低いOmcZSになる。C末端に6個のヒスチジンを付加したOmcZL全長を生産するG. sulfurreducensを作製し、HisTrapカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製OmcZLを大量調整した。本課題に取り組む以前に試みられたシッティングドロップ法による結晶化条件の検討では、1,152条件のうち、8条件で良好な結晶の形成が確認されていた。本研究では、それらの8条件について、塩濃度、沈殿剤濃度、pHを細かく振った条件をハンギングドロップ法によって試験した（全687条件）。その結果、14条件で良好な結晶が得られたため、それらについてX線回折データの収集を試みたところ、最大分解能2.5Åのデータを得ることに成功した。しかし、分子内に含まれる鉄原子（シトクロムのヘム由来）の異常分散効果を利用して構造解析を試みたが、現在までのところ位相の決定には至っていない。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 OmcZLの結晶構造解析について、以前は最大分解能3.4Åであったが、今回、2.5Åのデータを得ることに成功している。位相を決定すれば構造が明らかになる段階まで来ており、概ね順調といえる。
今後の研究の推進方策	OmcZLについては、現在までに複数の異なる条件での結晶が得られている状況であり、順次X線回折データの収集に取り組むとともに、鉄の異常分散効果を利用した位相の決定を試みる。構造が決定したら速やかに論文として発表する。また、明らかになった構造から電極との相互作用に重要を思われたアミノ酸について、アミノ酸置換を行った変異酵素を作製し、野生型との電極への電子伝達能力と比較する。さらに、現在大量発現系の構築を試みているOmcZ以外の細胞外シトクロムタンパク質OmcSとOmcBの大量発現系を構築し、それらの精製酵素を用いた結晶化を試みる。
次年度使用額が生じた理由	新型コロナウィルスの影響で参加予定だった学会が中止になったため。