| 研究課題/領域番号 |
19K05772
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
九町 健一 鹿児島大学, 理工学域理学系, 准教授 (70404473)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 窒素固定 / 放線菌 / 酸素 / 分子遺伝学 |
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| 研究実績の概要 |
窒素固定は大気中の窒素ガスからアンモニアを合成する反応であり、生態系への窒素養分の供給に重要な役割を担っている。窒素固定反応を行う酵素タンパク質は酸素によって損傷するので、多くの窒素固定細菌は低酸素環境で窒素固定を行う。Frankia属の放線菌は厚い外壁により酸素の流入を防ぐベシクルという構造体を発達させ、その内部で窒素固定酵素を発現するため、大気中でも窒素固定を行える。私たちはこれまでベシクルの発達が異常なFrankiaの変異体を多数単離している。本課題では、それらの特徴を詳しく調べて発達のどの段階に異常を持つかを知り、異常の原因となる遺伝子（変異原因遺伝子）を同定することを目指している。そのために、変異株の細胞集団の中から、DNA複製エラー等の２次的変異により窒素固定能が回復した回復細胞を単離培養する。回復株と元々の変異株のゲノム解析を行い、それらが持つ変異を比較することにより、回復株で復帰変異やサプレッサー変異が起きている遺伝子を特定する。
本年度は、３種の変異株について回復株を２～３株単離培養し、それらの表現型を詳細に解析した。全ての回復株において、アンモニア欠乏培地での増殖、窒素固定活性、ベシクル形成数が変異株と比べて有意に高まっていた。一部の株においては、ベシクル外壁の発達が回復しており、ベシクル内酸素濃度も低下していることも確認できた。2種の変異株および5種の回復株のゲノム解析を行い、復帰変異とサプレッサー変異の起きた遺伝子の特定を試みた。
変異原因遺伝子を特定するためには、形質転換法を確立することが大変重要である。コドン使用頻度とプロモーター配列をフランキアに最適化した人工的な抗生物質耐性遺伝子を広宿主域プラスミドに組み込み、エレクトロポレーション法によりフランキアの形質転換を試みた結果、予備的ながら遺伝子導入が起こっていることを示すデータが得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ベシクルをほとんど形成できない３種の変異株（G23G1、G21E10、G23C4）について：G23G1株については単一細胞由来の回復株を4株単離し、全ての株においてアンモニア欠乏培地での増殖、窒素固定活性、ベシクル形成数が回復していることを確認した。変異株のゲノム解析データを分析し、原因遺伝子候補を6個に絞り込んだ。G21E10株とG23C4株についても3及び4種の回復株を用いて同様の実験を行い、表現型の回復を確認した。これらの株においてはベシクル外壁の発達も回復していた。変異株および回復株のゲノム解析を行い、復帰変異の候補箇所を複数同定した。いくつかの遺伝子についてはサンガー法による解析を行ったが、原因変異である確証は得られなかった。
ベシクルの数や大きさは野生株と大差がないにも関わらず窒素固定が行えない２種の変異株（N9D9、N4H4）について：上述の表現型に加え、ベシクル内の酸素濃度も評価した。定性的ではあるが、酸素濃度が低下しており窒素固定酵素が失活を免れていることを示すデータが得られた。N9D9株については、転写因子をコードするFrancci3_2702遺伝子に一部の回復株で復帰変異が起きており、窒素固定能欠損の原因である可能性が示唆された。N4H4株については、1種の回復株のゲノム解析を行い変異株ゲノムと比較することにより、復帰変異の候補箇所が3カ所見つかった。
広宿主域プラスミドに、コドン使用頻度とプロモーター配列をフランキアに最適化した抗生物質耐性遺伝子と、他種の放線菌で機能する抗生物質耐性遺伝子をクローニングし、これを用いてフランキアの形質転換を行った。遺伝子導入はエレクトロポーレーション法を用い、条件は我々の研究室で一過的な形質転換に成功したものに従った。複数の抗生物質に同時に耐性を示す株が得られ、形質転換が起こっていることが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
ベシクルをほとんど形成できない変異株（G23G1、G21E10、G23C4）について：G23G1株については、複数の回復株のゲノム解析を行い復帰変異およびサプレッサー変異が起きた遺伝子を特定する。加えて、トランスポソンの転移により変異が誘発された可能性について、検討を行う。G21E10株およびG23C4株については、現時点でリストアップされている復帰変異箇所のサンガー法による確認を引き続き行う。原因変異が特定できなかった場合は、更なる回復株のゲノム解析を行う。
ベシクルの数やサイズは野生株と大差がないにも関わらず窒素固定が行えない変異株について：N9D9変異株についてはより多くの回復株を用いて表現型解析およびFrancci3_2702遺伝子の遺伝子型解析を行う。加えてベシクル内酸素濃度を定量的に解析し、変異株と比較して有意に低下していることを示す。N4H4株については、現時点でリストアップされている候補遺伝子の塩基配列のサンガー法による確認を引き続き行う。原因変異が特定できなかった場合は、更なる回復株のゲノム解析を行う。
形質転換候補株について：サザンブロットを行い確かに遺伝子導入が起こっていることを確かめる。また継代培養を続け、導入遺伝子が安定に維持されることを確認する。加えてGFP遺伝子の形質転換も行い、形質転換株が蛍光を示すことを確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナウイルスによる大学への入構制限のため、当初の計画より実験の量が少なかったため。
今年度行えなかった実験の遂行のために用いる。
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