| 研究課題/領域番号 |
19K05777
|
|---|
| 研究機関 | 大阪府立大学 |
|---|
研究代表者 |
谷 修治 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (80405357)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | ClbR / Uge5 / dppIV / SrpkF |
|---|
| 研究実績の概要 |
糸状菌におけるセルロース系バイオマスに応答した遺伝子の発現は、様々な環境要因に応答して複雑に制御されている。我々はこれまでに、転写因子ClbR、ジペプジジルペプチダーゼIV（DppIV）, 推定タンパク質リン酸化酵素SrpkF, UDP-glucose-4-epimerase (Uge5)が、炭素源に応答したバイオマス分解酵素遺伝子群の発現を制御する因子として同定した。本研究では、各因子の機能を多面的に解析している。
転写因子ClbRはそのパラログであるClbR２と相互作用することをYeast two hybrid法を用いて見出した。Biomolecular Fluorescence Complementation法を用いて糸状菌内に おけるClbRとClbR2の相互作用を解析し、パラログ因子を介した協調的な遺伝子発現制御機構を解析している。また、ClbRの部分欠失タンパク質を発現することによりClbRの機能を改変し、酵素生産量が改善した株の作出に取り組んでいる。推定タンパク質リン酸化酵素srpkFの高発現株を作出して機能を解析した結果、srpkFが関わるシグナル伝達経路を限定することに成功した。現在は、SrpkFのタンパク質リン酸化酵素としての機能を解析している。転写因子ManRは、セロビオースに応答した遺伝子発現とマンノビオースに応答した遺伝子発現の両方を制御する。我々はUge5が、ManRを介して選択的に異なる糖に応答する機構に関与していることを見出し、その制御に関わる因子を同定し解析している。DppIVは、糸状菌Aspergillus aculeatusにおいて、酸化ストレス応答に関与している。この応答は、DppIVのペプチダーゼ活性が関与していることが示唆されたため、DppIVの基質を同定するための研究を進めている段階である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
転写因子ClbRの機能解析については、転写活性化に関わるドメインを解析している段階である。Bimolecular Fluorescence Complementation法を用いたClbRとClbR2の相互作用解析に関しては、yellow fluorescent protein (YFP) を用いた系を構築中であり、ClbRとYFPのN末端部分、ClbR2とYFPのC末端部分の融合タンパク質を発現する株が取得でき次第、解析を進める。糸状菌A. aculeatusにおいてdppIVを高発現した株が酸化ストレス耐性を獲得した。この形質が真菌間で保存されているか検証するために、A. nidulans dppIV高発現株、Saccharomyces cerevisiae dppIVオルソログ高発現株を作出し、解析を進めている。S. cerevisiae においてもDppIVオルソログが酸化ストレス応答に関与していることが明らかになれば、ゲノム情報が整備されている酵母においてDppIVの基質を同定するための研究を展開する。推定タンパク質リン酸化酵素SrpkFの機能解析は、当初はSrpkFがリン酸化するターゲットタンパク質をenhanced ascorbate peroxidase (APEX2)を用いて網羅的にスクリーニングする計画であったが、遺伝学的にSrpkFが関与するシグナル伝達経路を限定することに成功した。そこでターゲットタンパク質候補のリコンビナントタンパク質を用いて、SrpkFが直接あるいは間接的にリン酸化するタンパク質を解析している。Uge5の機能解析については、Uge5欠損株の解析により明らかにされた転写因子ManRを介した選択的遺伝子発現制御に関わる転写因子と化合物の候補を見いだすことに成功した。現在、詳細に制御機構を解析している段階である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
上述の制御因子の機能を解析するとともに、得られた知見を基盤として各因子の機能を改変し、酵素生産量を改善した株の育種に向けた基盤を構築する。ClbRの転写活性化ドメインを同定し、改変ClbRを高発現することによる酵素高生産株の育種を目指す。DppIVに関しては、基質となるタンパク質を同定し、その機能の解明を目指す。SrpkFは、SrpkF内の推定アミノ酸ドメインに変異を導入し、その影響を解析しており、現在の予備的な試験結果を継続して検証する。Uge5に関しては、選択的な遺伝子発現に関与する因子の機能を継続的に解析し、酵素高生産株作出への基盤を構築する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画していたRNAシークエンス解析を行えていない。研究の進捗は遅れ気味であるものの、複数の因子の変異株を用いた解析が進めば、コントロール条件を共有するように一気にRNAシークエンス解析を行うことが、今後の研究のブレークスルーに繋がる。次年度に予算を繰り越し、解析を一気に行うことで、効率的に研究を展開する計画である。
|
