| 研究課題/領域番号 |
19K05778
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| 研究機関 | 東北学院大学 |
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研究代表者 |
宮内 啓介 東北学院大学, 工学部, 教授 (20324014)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 亜ヒ酸酸化 / バクテリア / Pandoraea |
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| 研究実績の概要 |
ヒ素高蓄積植物であるモエジマシダは、環境中のヒ酸を根から吸収し、亜ヒ酸はヒ酸に酸化してから吸収する。亜ヒ酸酸化細菌Pandoraea sp. NE5株は、モエジマシダ根圏から単離された、亜ヒ酸酸化能を有する細菌である。しかし、そのゲノム配列からは、既知の亜ヒ酸酸化酵素遺伝子であるaioABに相同性をもつORFは見出されなかった。そこで、本菌の亜ヒ酸酸化酵素遺伝子を明らかにするとともに、モエジマシダ根圏での本菌の役割を探ることとした。
昨年度までの研究で、NE5株にトランスポゾン（Tn）を導入し、亜ヒ酸酸化能が低下した変異株を24株得ている。そのうち、oxidoreductaseと相同性を示すORF（LOCUS_16990）にTnが挿入された変異株が24株中4株確認され、それぞれ異なる部位に挿入されていたことから、このORFが亜ヒ酸酸化に関わっている可能性が強く示唆された。昨年度に引き続き、相同組換えを用いたこのORFの破壊を試みた。接合伝達を用いて破壊用プラスミド(Km耐性遺伝子及びsacB遺伝子をもつ)を導入した結果、１回目の相同組換え体を得るためのプレーティングにおいて非特異的にコロニーが生じ、選択培地に特異的なコロニー（Km耐性、スクロース感受性）が生じなかった。エレクトロポレーションでプラスミドを導入した結果、選択培地で１回目の組換えが起きた候補株を得ることができたが、２回目の組換え体（Km感受性、スクロース耐性）を得ることができなかった。１回目の組換え体候補株においてプラスミドが挿入されているのか、またその挿入部位を確認する必要がある。LOCUS_16990高発現株についてはプラスミドを作製し、NE5株に導入しているところである。NE5株のゲノム配列については、DDBJに登録したデータを公開し、投稿した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
海外での研究滞在とキャンパス移転作業のため、研究期間が短縮された。モエジマシダへの接種実験は、上記理由のため苗の準備ができず、研究期間を延長して次年度に行うこととした。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、亜ヒ酸酸化酵素遺伝子のクローニングを進める。変異株のスクリーニングで得られたORFについては、破壊株の作製に取り組みつつ、高発現株の作製を行う。モエジマシダへの接種実験も行い、NE5株がモエジマシダの生育やヒ素吸収に与える影響を調べる予定である。NE5株の亜ヒ酸酸化活性は、定常期以降に現れるので、RNAの発現解析も行いたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
海外での研究滞在とキャンパス移転作業のため、研究期間が短縮された。遺伝子解析の委託費、試薬代等で使用予定である。
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