| 研究実績の概要 |
最終年度は簡便な大腸菌の形質転換法の開発を行った。大腸菌へのプラスミドDNAの導入には、煩雑なコンピテントセルの作製が必要となる。一般的に、コンピテントセルの作製には対数増殖期の培養液や複数回に及ぶ遠心操作が必要となり、そのための時間や手間が大きな負担となる。本研究では、マイクロチューブ内の大腸菌培養液からこれらの煩雑な操作を行わずにコンピテントセル作製が可能であることを見出した。この方法では、マイクロチューブ内で一晩培養した大腸菌培養液をコンピテントセルとして使用する。この方法は、極めて簡便な操作のみで可能であり、大幅に手間やコストが削減可能であるため、大腸菌を用いたDNA操作を必要とする研究が大きく加速されることが期待される。
本研究では、大腸菌が形質転換時にどのような機構によりプラスミドDNAを取り込むのかについて解析するとともに、簡便に形質転換を行う方法の開発を行った。
まず、大腸菌の形質転換効率を向上させる変異としてenvZ遺伝子欠失株を見出した。envZ遺伝子欠失株の外膜タンパク質組成を解析したところOmpC, OmpFの発現量が低下し、OmpAの発現量が上昇していた。また、ompC遺伝子の欠失株においてもOmpAの発現量が上昇するとともに形質転換効率が上昇した。これらの結果からOmpAタンパク質がDNA取り込みの際に重要であることが示唆された。OmpAの発現を負に制御するmicA及びrseXをゲノムから欠失させた変異株の作製を行った。このsmall RNA破壊株では形質転換効率の向上が見られた。この菌株を用いることでより効率の良い形質転換が可能となることが期待される。
また、手間のかかるコンピテントセル作製を簡便に行う方法の開発を行った。これにより、より手軽に大腸菌へのプラスミドDNAの導入が可能となることが期待される。
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